实时荧光定量PCR结合探针检测MP的临床价值及MP耐药情况分析

杜金龙， 冯 燕， 李恒涛

（1.上海市奉贤区奉城医院检验科，上海 201411；2.上海市奉贤区奉城医院儿科，上海 201411）

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染可发生在不同年龄段儿童，据相关流行病学研究报道，MP年感染发生率为10.6%～67.6%，是儿童急性上、下呼吸道感染的病原体之一[1]。目前临床常用大环内酯类抗菌药物（如阿奇霉素）对儿童MP感染进行治疗，但临床报道MP对此类抗菌药物的耐药性呈阶梯式增高。早期准确诊断对减少抗菌药物滥用及降低患儿病死率有着重要意义[2]。目前MP感染诊断主要依靠实验室MP培养，但是MP培养不仅技术要求高、耗时长而且阳性率低，在临床早期诊断中应用受限[3]。近年来，MP核酸检测[实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）]在临床上应用的报道越来越多，而核酸扩增技术对提高病原检出率有着积极作用，但因MP-DNA序列突变所致的对大环内酯类抗菌药物的耐药现象愈发严重[4]。因此，有必要对MP耐药突变开展核酸鉴定。本研究评价实时荧光定量PCR技术结合探针检测MP-DNA及耐药突变位点的方法对MP感染诊断的准确性，并分析相关影响因素及耐药突变率，为临床早期诊断与目标用药提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取上海市奉贤区奉城医院儿科2017年9月—2019年8月收治入院的70例MP感染患儿作为MP组，选取同期入院的30例非MP感染患儿作为对照组。此次研究在上海市奉贤区奉城医院伦理委员会指导下开展，入组患儿家长均签署知情同意书。

1.2 纳入标准与排除标准

1.2.1 纳入标准 （1）MP感染儿童纳入标准。均符合《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识》（2015年版）[5]中相关诊断标准；以发热、咳嗽为主要症状，且多为阵发性干咳；胸X线检查结果可见肺实质阴影、肺门淋巴结肿大或全肺野弥漫性阴影等；单份血清标本MP-IgM抗体滴度≥1∶160，或急性期及恢复期（间隔2～4周）血清标本抗体滴度呈4倍或4倍以上变化（升高或降低）；未合并其他病原体感染。（2）对照组患儿纳入标准。经临床胸X线检查与症状诊断，排除MP感染的其他类型肺炎；单份血清标本抗体滴度≤1∶80；其肺炎类型均能检测出确切的病原体。

1.2.2 排除标准 （1）MP感染患儿排除标准。因反复呼吸道感染入院；合并免疫缺陷性疾病；经实验室检测合并病毒或细菌感染；结核病患儿。（2）对照组患儿排除标准。合并免疫缺陷性疾病；排除MP感染但病原体不明。

1.3 患儿治疗与基本资料采集

采集入组患儿的性别、年龄、入院时病程、入院前大环内酯类抗菌药物治疗史以及治疗4周内单份/双份血清抗体滴度等临床资料，进行定义与分组：（1）长病程组。入院时病程超过7 d患儿；（2）短病程组。入院时病程在7 d及以内患儿；（3）完成1个疗程组。入院前已接受阿奇霉素治疗，单次给药10 mg/（kg·d），首剂加倍，规律服药＞3 d，末次服药距首次服药时间满5 d，或连续服用其他大环内酯类抗菌药物（如红霉素）推荐剂量满5 d患儿；（4）未完成1个疗程组。口服阿奇霉素或其他大环内酯类抗菌药物不足1个疗程患儿；（5）未服用组。未服用大环内酯类抗菌药物治疗患儿；（6）双份血清4倍变化组。治疗期间急性期及恢复期血清抗体滴度呈4倍或4倍以上变化（增高或降低）患儿；（7）单份血清变化组。治疗期间单份血清标本抗体滴度≥1∶160，未出现双份血清滴度变化患儿。

1.4 方法

1.4.1 MP核酸检测 采集患儿入院12 h内咽拭子标本，置于无菌玻璃管，采用0.9%氯化钠溶液进行样本处理，保存于-20 ℃待测。采用MP核酸及耐药突变位点检测试剂盒（实时荧光定量PCR）（杭州美联生物科技有限公司）进行MP基因组DNA提取与检测。采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行扩增，扩增条件：50℃ 2 min，95 ℃ 2 min；91℃15 s，64℃ l min，40个循环。MP核酸及耐药突变位点检测试剂盒采用VIC、FAM与CY5这3种荧光进行实验，其中VIC信号指示MP，FAM信号指示23SrRNA2063位点或2064位点A：G突变，CY5信号指示内标。当待测样本FAM信号循环阈值（cycle threshold，Ct）＜35.33、VIC信号Ct＜35.01时指示MP检测阳性且发生A2063G和/或A2064G耐药突变；当待测样本FAM信号Ct≥35.33、VIC信号Ct＜35.01时指示MP检测阳性但未发生A2063G或A2064G耐药突变；当待检测样本VIC信号Ct＞35.01时判定为阴性。

1.4.2 MP-IgM抗体检测 抽取患者静脉血2 mL并分离血清，使用人肺炎支原体抗体IgM（MPIgM）酶联免疫吸附试验检测试剂盒[艾柏森（北京）生物科技有限公司]进行MP-IgM抗体检测，检测过程严格按照试剂盒检测说明书进行。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，其中计数资料以[例（百分比）]表示，组间阳性率比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿基本资料

根据本研究纳入标准，MP组患儿共70例，其中男38例 （54.3%）、女32例（45.7%），年龄0.5～17.2岁，中位年龄7.4岁，平均病程9.4 d。MP组患儿中长病程患儿38例，短病程组32例；完成1个疗程患儿28例 ，未完成1个疗程患儿29例，未服用患儿13例；单份血清变化患儿45例，双份血清4倍变化患儿25例。对照组（非MP感染）患儿共30例，其中10例为细菌性肺炎，12例为病毒性肺炎，8例为肺结核。

2.2 实时荧光定量PCR结合荧光探针诊断MP的准确性及其影响因素分析

70例MP感染患儿中MP-DNA阳性56例，阳性率为80.0%。患儿性别、病程、大环内酯类抗菌药物治疗史对检出率均无明显影响（χ2=0.001、0.705、1.103，P＞0.05）；双份血清4倍变化组MP-DNA阳性检出率（92.0%）明显高于单份血清变化组MP-DNA阳性检出率（71.1%），组间比较差异有统计学意义（χ2=4.165，P＜0.05）。见表1。

表1 MP感染患儿MP-DNA阳性检出率比较例（%）

2.3 56例MP-DNA阳性患者耐药突变分析

56例MP-DNA阳性患儿中有48例检测出耐药突变，其MP耐药突变阳性率高达85.7%；不同性别之间的MP耐药突变阳性率差异无统计学意义（χ2=2.550，P=0.110）；完成1个疗程组、未完成 1个疗程组及未服用组的MP耐药突变率分别为90.5%（19/21）、80.0%（20/25）及50.0%（5/10），3个组比较差异有统计学意义（χ2=6.646，P=0.036）。见表2。

表2 56例MP-DNA阳性患者耐药突变分析 例（%）

3 讨论

MP是引起儿童呼吸道感染的主要病原体之一。近3年来，上海市奉贤区奉城医院接诊的MP感染患儿数量呈上升趋势，且发现MP对大环内酯类抗菌药物的耐药率由2008年的3.2%增至2018年的30.5%。2016年冯真英等[6]和2018年倪珊珊等[7]先后报道培养分离到对大环内酯类抗菌药物耐药的MP，且其耐药率远高于以往文献报道。早期、准确地诊断是否有MP感染及耐药情况对避免抗菌药物滥用、提高临床疗效和促进患儿预后意义重大。

MP培养是目前公认的诊断MP感染的金标准，但由于实验室培养敏感性、特异性差，且所需时间较长，故不适用于早期诊断[8]。核酸检测因具有诊断准确性高、检测步骤简单、耗时短等优点已被广泛应用于临床[9-10]。本研究采用实时荧光定量PCR结合探针检测的方法对MP患儿进行诊断，其结果显示，PCR结合探针诊断MP感染的阳性率为80.0%（56/70），相比于其他MP核酸检测方法，PCR扩增结合探针显示出相近或更高的诊断准确性。冯雪莉等[11]探讨恒温扩增检测MP-RNA在儿童MP感染中的诊断价值，结果其敏感性达75.0%，特异性达89.7%。顾文婧等[9]采集MP感染患儿鼻咽抽吸物进行MP-DNA检测，发现病程≤1周患儿检出率为69.0%。虽然MP-DNA检测的诊断准确性较高，但应考虑到在病原微生物死亡后DNA还可以在体内存留一定时间，此时MP-DNA检测结果阳性并不代表病原体处于存活状态，因而在对患儿进行诊断与用药时，临床医生还应根据临床症状来进行综合性判断[12]。

本研究还对PCR结合探针诊断准确性的影响因素进行了分析，发现有81.4%（57/70）的患儿入院前已在其他医疗机构接受大环内酯类抗菌药物治疗。有研究报道患儿发病初期MP-DNA的阳性率较高，提示MP在机体内有感染与复制[13]。本研究中完成1个疗程组、未完成1个疗程组及未服用组的MP-DNA阳性检出率差异无统计学意义（χ2=1.213，P=0.545）。入院前使用大环内酯类抗菌药物进行治疗的患儿，入院时的MP-DNA阳性检出率未见有效降低，这也有可能是我们接诊的MP肺炎患儿携带的MP耐药菌株比例较高。

目前对MP的诊断主要依赖于血清学抗体检测，具有敏感性高、特异性强的特点，但耗时长、价格昂贵、对技术人员要求高，制约了其在临床中的普及。患儿MP感染后，机体内最早产生的抗体即为MP-IgM抗体，然而其形成尚需一段时间，一般在感染后7～10 d可被检测到，3～4周达高峰，并可持续数月，采集急性期与恢复期双份血清标本进行MP-IgM抗体检测对临床诊断具有参考价值。双份血清MP-IgM抗体滴度呈4倍或4倍以上升高或降低对MP感染的早期诊断有意义。在本研究中，双份血清4倍变化组MP-DNA阳性检出率（92.0%）明显高于单份血清变化组（71.1%），组间比较差异有统计学意义（χ2=4.165，P=0.041）。此外，顾文婧等[9]也报道，实时荧光定量PCR对MP-DNA的阳性检出率与双份血清抗体滴度呈4倍变化的一致性较高，提示临床诊断MP肺炎时以双份血清抗体滴度呈4倍或4倍以上升高或降低作为诊断标准，可获得更高的诊断准确率。

近年来，国内外均有文献报道分离出对大环内酯类抗菌药物耐药的菌株。根据目前对MP耐药机制的研究发现[14]，其主要机制是抗菌药物作用靶位基因的点突变，主要为核糖体的23SrRNA V区中心环的点突变，而MP在23SrRNA基因的A2063G与A2064G碱基突变通过使大环内酯与MP核糖体亲和力降低而产生耐药。本研究结果显示，56例MP-DNA阳性患儿中有48例检测出A2063G和/或A2064G突变，其中检测出单纯A2063G突变65例、单纯A2064G突变68例、A2063G联合A2064G突变35例，其MP耐药突变阳性率高达85.7%，另规律完成大环内酯类治疗1个疗程组的MP耐药突变率为90.5%，明显高于未完成1个疗程组（80.0%）及未服用组（50.0%），3个组比较差异有统计学意义（χ2=6.646，P=0.036）。该结果提示，MP肺炎对大环内酯类抗菌药物具有严重的耐药性，其耐药机制主要是23SrRNA基因位点突变，也进一步证实了MP肺炎患儿对大环内酯类抗菌药物的耐药形势相当严峻，提示MP核酸检测可为临床用药调整提供依据，具有较为广阔的临床应用价值。

综上所述，应用实时荧光定量PCR结合探针对MP肺炎进行诊断，其敏感性和特异性均较高，从本研究结果来看，MP-DNA耐药突变率较高，临床对MP患儿的治疗用药应根据耐药性予以调整。