以蛋白质衣壳为载体的纳米反应器研究进展

秦 钰

（天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072）

在自然界中，蛋白质凭着它结构上的多样性以及由此带来的在功能上的多样性，从而成为最基本的生物大分子而出现在各种重要的生命过程中。其中，蛋白质衣壳是由蛋白质亚基自组装形成的一种超分子纳米笼，具有分布广、种类多、可再生、单分散、结构高度有序、易制备等特点，并且可以封装各种类型的纳米颗粒。常见的蛋白质衣壳包括病毒样颗粒（Virus-like Particles,VLPs）、细菌中发现的蛋白质衣壳或者通过计算技术设计的蛋白质衣壳。在药物递送、生物影像标记、免疫学和限域纳米催化剂的开发上具有较大的应用潜力，尤其是限域纳米催化剂方面的应用，近年来备受人们的关注[1]。

纳米反应器是一种可以将反应限制于纳米空间范围内的容器。相对于在本体溶液中发生反应，限制于特定空间的反应能够更好地模拟自然界的方式，从而带来更多的启发与理解[2]。其中，限域纳米催化剂就是将催化剂装载于纳米载体中，这是最直接与常见的制造纳米反应器的方式。由于空间的限制，所装载的催化剂在大小与种类上要满足相应的条件是不容易的，而自然界中常用于生物催化的酶（绝大多数为蛋白质）显然最适合作为限域纳米催化剂中的催化剂。

1 包囊在酶活性调节中的作用

封装酶时，有几个可能会影响酶活性的因素。第一，酶蛋白与衣壳间的相互作用可能会影响其活性位点的构型，从而使酶的内在动力学参数改变。第二，衣壳上有限的通道会影响底物扩散进入活性位点以及产物释放到本体溶液的过程。第三，将连续反应中出现的多种酶封装于同一载体中，有助于将中间体捕获进而进入下一反应阶段，特别是在本体溶液中底物浓度低的情况下，这种方法将会提高反应物转化为最终产物的效率。

总之，封装在酶活性调节中的作用可能非常复杂。每种情况可能会遇到不同的机制，或者是多种机制共同作用而产生的影响，最终效果会不一样。

2 自然界中的纳米反应器

大自然选择分区[3]来减少副产物的形成并提高反应速率。通过构建工程化的纳米反应器，可以通过研究其产品的独特特性及其对反应动力学的影响来帮助我们更好地了解自然界的创造[4]。在不同的纳米颗粒之间，使用单分散的蛋白质衣壳可以帮助研究研究密闭空间中酶促反应[5]。

据报道，Encapsulin蛋白存在于许多细菌和古细菌基因组中，大多组装成T=1（60个亚基，20-24nm）或者 T=3（180 个亚基，30～32nm）的二十面体空心衣壳[6,7]，其封装肽标签的发现[8]非常有趣。Encapsulin壳蛋白所装载的蛋白是通过观察其高分辨率结构所发现的，通过T.maritima encapsulin的晶体结构初步了解其封装机理。在晶体结构中研究者发现大约有10个氨基酸总是出现在囊蛋白壳的内部，这10个左右的氨基酸对应于装载蛋白的短C-末端序列。生物信息学分析证明这段C末端序列在其他物种的Encapsulin中也得到保留，并且在推断的操纵子中编码货源蛋白与Encapsulin蛋白的基因是相邻的，于是人们将这段重复出现的序列所编码的蛋白称为货物装载肽（CLP,cargo loading peptide）。将CLP从货源蛋白中除去会使得货源蛋白无法再被Encapsulin蛋白封装，但是如果把CLP融合在原本不被Encapsulin蛋白封装的绿色荧光蛋白的C末端上，便足以使得绿色荧光蛋白被封装，于是人们认为CLP对于货源蛋白封装于Encapsulin蛋白中是充分必要的。发现CLP后，鉴定不同的货源蛋白家族取得了更多进展。Encapsulin蛋白的大部分货物都是酶，它们在微生物中关键的细胞过程中起着重要作用，而将这些蛋白封装于Encapsulin蛋白中，不仅可以提升货源蛋白的稳定性以及在发挥货源蛋白功能的环境中提高其半衰期，还能够隔绝毒性反应。

另一个著名的天然纳米反应器是细菌微区室（BMC,bacterial microcompartments）[9]，是一种自组装的细胞器，这些细菌微区室的共同结构特点是位于微区室中心的酶被一种选择性通透的蛋白质外壳包裹。这种微区室的作用在于可以限制气体底物，保护细胞免受毒性中间体的侵害并防止副反应的产生。细菌微区室在60年前第一次被观测到，但主要是在近几年才取得更多的研究进展，这些进展中包括理解其代谢多样性、自组装的结构基础以及功能作用，对于促进对细菌代谢的理解及开始将BMC应用于合成生物学起到了极大的推动作用。在所研究的BMC中，特别突出的就是羧酶体（carboxysome），该细胞器对于理解微区室蛋白外壳如何组装，以及它如何让一些化合物通过同时阻挡其他的化合物进入蛋白质衣壳内有着重要的意义。羧酶体的蛋白质结构为对称性的多面体壳结构，其蛋白质外壳具有选择性让分子通过的通透屏障，可以防止CO2的损失。羧酶体的内部包含碳酸酐酶（CA）以及核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO），碳酸酐酶是催化碳酸氢盐转化为CO2（反之亦然）的酶，羧酶体外壳让碳酸氢盐透过，包裹于其中的碳酸酐酶催化碳酸氢盐转化为CO2，CO2气体不仅会被羧酶体蛋白外壳限制，并且会被RuBisCO固定下来，该酶是通过催化1,5-二磷酸核酮糖与CO2的羧化反应或与O2的氧化反应来固定住CO2的。RuBisCO分子量约为53kD，由8个大亚基和8个小亚基组成，它在卡尔文循环里催化第一个主要的碳固定反应。同时将碳酸酐酶与RuBisCO包裹在蛋白质外壳中，形成了天然的纳米反应。更好地认识与理解该天然纳米反应器的结构与功能，有助于开展改善碳固定——更广泛地说是生物能源的研究，也为研究者们开发利用这个天然的反应器来达成其他特定效果的人工纳米反应器开辟了新的道路。

3 封装酶的工程化系统

研究者越来越多地使用病毒蛋白外壳，细菌蛋白外壳或通过计算技术发现的蛋白质衣壳来创建工程化的纳米反应器[10-12]。

豇豆褪绿斑驳病毒（CCMV）蛋白质衣壳在自然条件下携带的RNA大小为28nm，如今通过已建立起来的方法而较好地应用于封装各种客体酶蛋白。CCMV衣壳因其在pH值为7.5的条件下分解为90个二聚体，但在pH值为5.0时可重新形成衣壳，而用于封装辣根过氧化物酶（HRP），由HRP以及CCMV蛋白衣壳组成的新型纳米反应器，经过酶活性的研究测试表明酶活性依旧存在，说明CCMV蛋白质衣壳对于底物与产物都是可渗透的[2]。Minten等[13]将带正电荷的异二聚体卷曲螺旋蛋白附着在衣壳蛋白上，在非共价作用下将货源蛋白包封于CCMV蛋白衣壳内，这种方法的开发使得CCMV衣壳包封多种蛋白成为可能。Minten等[2]人使用CCMV衣壳包封了被称作Pseudozyma脂酶B（PalB,Pseudozyma lipase B）的多种功能酶，该实验表明，封装的PalB比未封装的PalB更有效地转换了底物，并显示了在衣壳的受限空间中进行级联反应的潜力。

噬菌体MS2衣壳是二十面体球，由180个相同蛋白质单体组成，平均直径为27nm。在自然条件中噬菌体MS2衣壳是病毒遗传信息RNA的载体。该蛋白质衣壳的单体可以独立表达，并且可以通过简单的方法可以去除大肠杆菌中原本装载的RNA而自组装成病毒状的空衣壳[14]。化学修饰的MS2衣壳内表面可与想装载的酶通过共价结合而行成新的纳米反应器系统，最终形成了靛蓝生物合成途径[15]。与体外游离酶相比，体内靛蓝产量增加且货物酶的长期稳定性增强[15]。

噬菌体Qβ与MS2类似，也是二十面体病毒样颗粒（VLPs,virus-like particles），由称为外壳蛋白（CP,coat protein）的 180个亚基组成[16]。Fiedler等[16]利用在RNA基因组中发现的发夹结构与CP的内部残基之间的高亲和力相互作用特性，将与发夹结构融合的不同酶靶向到Qβ衣壳上，从而提供一种简单的方法将想要的货源酶装载于Qβ衣壳中，以更好地利用不稳定的或难以纯化的酶。其中装载成功的肽酶E（PepE,peptidase E）和荧光素酶（@（RevLuc）4）在游离与装载状态下的酶活性被测量出来而归纳于下面的表格（表1）中。

噬菌体P22通过控制自组装的进程来封装活性氢和耐氧[NiFe]-氢化酶而被设计成制氢工厂[17]。通过对具有红外光谱特征的新型生物反应器进行表征并测量其催化活性，发现封装的氢化酶的活性比纯化的游离酶高近100倍，并且P22衣壳避免其货物因加热和被蛋白酶水解而带来的影响[17]。

存在于许多生命中的铁蛋白也是蛋白质衣壳，被生命体用于贮存铁，并且通常比用于封装蛋白质的其他蛋白质容器小，例如P22，CCMV和工程化的核黄素合酶变体。铁蛋白的外径为12nm，内径为8nm。铁蛋白已被用于包裹金属离子或酶来产生不同的纳米反应器[18，19]。Stephan Tetter和 Donald Hilvert[20]使用内部带负电的古细菌古球菌（AfFtn）的工程铁蛋白来包封3种不同的酶，与带正电的绿色荧光蛋白融合的不同种类的酶。他们通过比较这些酶装载前后的活性，证明衣壳能够保持酶的催化活性，并防止装载酶被蛋白酶水解以及避免加热带来的影响[20]。

对于这些工程系统，装载前后的酶活性已归纳于下表中（表1）。由此可以看出，不同衣壳对于酶的影响不一样，或是使酶活性降低，或是保持不变，但使酶活性升高的衣壳较少出现。

表1 不同蛋白质衣壳对货源酶活性的影响Tab.1 Influence of different capsids to their cargo enzyme activity

4 结论与展望

以表1中Qβ蛋白外壳装载肽酶E和荧光素酶的系统为例，比较装载前后酶活性的数据来计算得到的结果进行分析，装载肽酶（PepE）的Km相比游离酶来说略微上升，而kcat的值变为游离酶的一半左右，于是kcat与Km的比值也下降了一倍多，由此可见，装载的肽酶的酶活性是降低的，这可能是由于酶蛋白和发夹结构融合后对该酶内在动力学参数有影响，使其催化效率降低。而装载的荧光素酶的情况与上者有相似又有些不同，它们相似的地方在于装载的荧光素酶的kcat的值也变为游离酶的一半左右，不同在于装载的荧光素酶的Km值竟然达到了游离酶的18倍左右，由此推测，荧光素酶装载后，蛋白质外壳会成为反应底物扩散进入被装载酶活性位点的阻碍，或许是荧光素酶的反应底物相比肽酶的反应底物来说更难以进入Qβ衣壳之中，而相似的kcat值上的改变，说明与酶蛋白融合的发夹结构也会影响荧光素酶的酶活性，降低其催化效率，或许这是由于该结构普遍存在的对酶蛋白的影响。这些推测仍然需要被验证，但可以得到的较为确定的结论是，同一个蛋白质外壳对不同酶存在的影响是不同的，而这其中影响酶活性的原因存在多种可能性，是一个复杂的过程，或许深入研究一种有潜力的蛋白质外壳，掌握其影响酶活性的机理，对于更好地利用该种载体在更多的场景下的包载具有很大帮助。

总结来说，蛋白质衣壳对于货运酶的影响是由复杂的机理控制，具体情况仍然需具体分析；而将酶装载于不同性质的蛋白质衣壳中，对于将酶投入工程化使用、改变酶本身的性质等都是很有潜力的研究。