电针对PSD大鼠前额叶和海马BDNF、CREB表达调控的影响

徐鸣曙 ，张卫 ，张杏林 ，张英杰 ，张荻 ，程爱芳

(1.上海市针灸经络研究所，上海 200030;2.厦门市中医院，福建 361009;3.上海中医药大学，上海 201203)

卒中后抑郁(post stroke depression， PSD)是卒中后最常见的精神神经并发症[1]，大约 30%～50%的患者在卒中后出现焦虑或抑郁问题[2]。PSD损伤患者认知功能[3]，妨碍患者肢体功能恢复，增加卒中患者的死亡率和致残率[4]，极易出现“因病致郁”“因郁致病”的恶性循环。PSD的发生与单胺类神经递质功能紊乱、细胞炎性因子、神经细胞的损伤和凋亡有关[5-8]。盐酸氟西汀作为治疗PSD的临床一线药物，属于选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors， SSRIs)，能使体内 5-羟色胺保持较高含量，产生抗抑郁作用，常被用于抗抑郁的对照研究[9]。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)，是神经元再生的关键因子[10]，维持神经元的生存、生长和分化，提高单胺递质水平[11]。环磷腺苷反应元件结合蛋白(cyclic-AMP response element binding protein， CREB)是核转录因子家族中的一员，调节促细胞生存、生长、分化和神经可塑性的基因表达[12]，促进BDNF的转录[13]。BDNF和CREB在PSD中的作用日益受到研究者的重视， Cao K等[14]研究发现，PSD大鼠海马中同时存在BDNF、CREB表达下降，使用抗抑郁药能够逆转这一过程。本研究观察电针干预后，PSD模型大鼠行为学改变以及前额叶和海马BDNF、CREB表达的变化，通过与氟西汀的对比，揭示针刺干预PSD的作用特点，为临床防治PSD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性清洁级SD大鼠40只，体质量(250±20)g，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心提供[实验动物许可证号为 SYXK(沪)2013-0109]，室温(24±2)℃，湿度 40%～70%，明暗光照交替 12 h/12 h，适应性饲养1周后进行实验。实验方法符合国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》，经过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院伦理委员会审查。

1.2 主要仪器

0.25 mm×25 mm一次性针灸针(吴江市云龙医疗器械有限公司);100 cm×100 cm×50 cm木制无盖敞箱(香港友诚生物科技有限公司);Fresco21台式高速冷冻离心机(Thermo);Mutiskan GO全波长酶标仪(Thermo);POWER PAC 3000伯乐电泳仪(BIO RAD);GIS-1600凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);Roche480Ⅱ荧光定量PCR仪(Roche)。

1.3 药品与试剂

盐酸氟西汀胶囊(Patheon france);0.9%氯化钠注射液(浙江济民制药股份有限公司);CREB(48H2)Rabbit mAb(Cell signaling technology);RNA酶抑制剂(Invitrogen);Anti-BDNF antibody(3B2)(英国Abcam)。

1.4 模型制备

1.4.1 大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型制作

参照本课题组报道[15]的线栓法 MCAO模型进行造模。造模前大鼠禁食不禁水 12 h。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，做颈部正中切口，钝性分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。结扎颈外动脉远心端，用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉。在颈外动脉近心端距离分叉2～3 mm穿1根4号缝合线并打一虚结，在颈外动脉远心端结扎处和虚结之间处剪一小口，插入栓线后，系紧虚结，松开动脉夹，剪断颈外动脉，将栓线推入颈内动脉，长度约 18 mm。逐层缝合，乙醇棉球消毒。保温，复苏，90 min后进行再灌注，将栓线拔出至有阻力，剪掉露出皮肤外面的栓线。

1.4.2 大鼠PSD模型制作

采用慢性不可预知应激抑郁症(CUMS)模型[16]，在MCAO模型大鼠术后第2天，相继给予慢性温和不可预知应激处理，包括夹尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、束缚5 min、昼夜颠倒24 h、45℃烘箱热刺激5 min、4℃冰水游泳5 min。每日随机采用1种方法应激大鼠，同一种方法在同一个周期(7 d)内不重复出现，连续应激21 d。

1.5 实验分组及干预方法

大鼠适应性喂养 1周后，禁水 24 h，进行旷场(Open-Filed)实验。将评分相近的大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和电针组，每组10只。正常组孤养不作任何处理，其余各组在PSD模型制备成功后第2天给予相应处理。模型组大鼠给予 2 mL 0.9%生理盐水灌胃，连续 21 d。西药组大鼠给予盐酸氟西汀溶液(0.2 mg/kg盐酸氟西汀溶于2 mL生理盐水中[17])灌胃，连续21 d。电针组大鼠予以电针治疗，取百会、丰隆、太冲、三阴交(穴位定位参照李忠仁主编《实验针灸学》[18])，百会斜刺进针，余穴直刺，使用韩氏电针治疗仪，针柄接丰隆、太冲，频率 2 Hz，电流强度以大鼠耐受，两耳微微震动为宜。每日治疗 30 min，连续治疗21 d。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠神经功能缺损评分

本研究采用 Menzies[19]改进评分法在造模前、造模后2 h、造模后24 h、应激21 d后和治疗21 d后对大鼠进行神经缺损评分。大鼠左前肢出现肩或(和)肘内收屈曲，肩关节内旋，或者肩肘关节屈曲同时伴有内旋者，计为1分，无此现象则计为0分;大鼠左前肢阻力减小或(和)行走偏左侧，或(和)向左侧转圈，计为 1分，无此现象则计为 0分;大鼠左前肢肌张力下降，计为1分，无此现象则计为0分;大鼠不停地向脑损伤对侧一个方向旋转者，计为1分，无此现象则计为0分。满分为4分，1～4分为有效模型。

1.6.2 大鼠体质量

分别于应激0 d、应激21 d后、治疗21 d后记录大鼠体质量。

1.6.3 大鼠行为学观测

1.6.3.1 旷场实验

分别于应激0 d、应激21 d后、治疗21 d后进行旷场实验，测试动物的自发活动情况及其对开阔环境的焦虑行为。将长宽均为100 cm、高50 cm，底面和四周均为黑色的无盖木质敞箱底面划分为 16个面积为25 cm×25 cm的小方格，将大鼠放在敞箱中心位置，观察其在3 min内活动情况，以穿越地面方块数作为水平运动得分，后肢直立次数作为垂直运动得分[20]。水平运动主要反映动物的活动度，垂直运动则反映了动物对新环境的探索情况。

1.6.3.2 糖水试验

分别于应激0 d、应激21 d后、治疗21 d后进行糖水消耗试验，以检测动物对奖赏的反应性。将大鼠禁食禁水8 h后，同时给予已称重的2%蔗糖水和蒸馏水各1瓶，24 h后调换蔗糖水和纯水的位置，48 h后再次对两瓶进行称重。大鼠糖水消耗量(%)=蔗糖水饮用量/(蔗糖水饮用量＋蒸馏水饮用量)×100%[21]。

1.6.4 大鼠前额叶和海马 BDNF、CREB、BDNF mRNA、CREB mRNA表达

治疗结束后，每组随机选取6只大鼠断头取脑，在冰盘上迅速分离出前额叶和海马，置于冻存管中，-80℃保存。Western blot检测BDNF、CREB蛋白水平，每20 mg脑组织加入100 μL裂解液，在匀浆机中充分裂解后，12000 rpm，离心5 min;取上清蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，配胶，转膜(200 mA，70 min);加入二抗(Jackson 1:2000)，4℃孵育过夜;TBST洗膜，于化学发光检测试剂反应2 min;暗室中用X胶片感光、显影、定影。

RT-PCR检测BDNF mRNA、CREB mRNA的表达。提取脑组织总RNA，根据试剂盒操作说明，进行逆转录反应，荧光定量PCR扩增。引物序列为5’-GCG GCA GAT AAA AAG ACT GC-3’，5’-GCA GCC TTC CTT CGT GTA AC-3’，5’-ACC AGC AGA GTG GAG ATG CT-3’，5’-GGG CTA ATG TGG CAA TCT GT-3’。冰上配制PCR反应液体，3次独立实验后得到的数据进行分析。

1.7 统计学方法

采用 SPSS24.0统计软件对相关数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析;不满足正态分布计量资料采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

造模前，各组大鼠神经功能缺损评分比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。MCAO造模后2 h、MCAO造模后24 h、应激21 d后，模型组、西药组、电针组大鼠神经功能缺损评分显著升高(P＜0.05)，提示 MCAO模型制备成功。治疗21 d后，西药组、电针组大鼠神经功能缺损评分较模型组显著降低(P＜0.05)。详见表1。

2.2 各组大鼠体质量比较

应激 0 d，各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。应激21 d后，模型组、西药组、电针组大鼠体质量均明显低于正常组(P＜0.05)。治疗 21 d后，西药组、电针组大鼠体质量较模型组明显升高(P＜0.05)，但仍低于正常组(P＜0.05);西药组和电针组大鼠体质量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表2。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 (±s，分)

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 (±s，分)

注:与正常组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与西药组比较 3)P＜0.05;与电针组比较 4)P＜0.05;与造模前比较 5)P＜0.05

组别 n 造模前 MCAO造模后2 h MCAO造模后24 h 应激21 d后 治疗21 d后正常组 10 0.00±0.00 0.00±0.002)3)4) 0.00±0.002)3)4) 0.00±0.002)3)4) 0.00±0.002)3)模型组 10 0.00±0.00 2.13±0.841)5) 2.25±0.711)5) 1.25±0.461)5) 1.13±0.641)3)4)5)西药组 10 0.00±0.00 2.25±0.711)5) 2.38±0.741)5) 1.38±0.741)5) 0.63±0.521)2)5)电针组 10 0.00±0.00 2.00±0.761)5) 2.13±0.991)5) 1.13±0.841)5) 0.38±0.522)

表2 各组大鼠体质量比较 (±s，g)

表2 各组大鼠体质量比较 (±s，g)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与西药组比较3)P＜0.05;与电针组比较4)P＜0.05

组别 n 应激0 d 应激21 d后 治疗21 d后正常组 10 273.94±12.70 390.44±9.49 459.44±11.822)3)4)模型组 10 273.38±4.57 348.00±29.901) 418.06±12.041)3)4)西药组 10 283.75±8.53 347.56±12.671) 432.94±8.861)2)电针组 10 276.00±19.29 344.19±12.661) 434.06±6.041)2)

2.3 各组大鼠旷场实验得分比较

应激 0 d，各组大鼠旷场实验得分比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。应激21 d后，模型组、西药组、电针组大鼠旷场实验水平运动和垂直运动得分显著降低(P＜0.05)。治疗21 d后，模型组大鼠旷场实验水平运动和垂直运动得分持续降低(P＜0.05);西药组、电针组大鼠旷场实验水平运动和垂直运动得分较模型组和应激21 d时明显升高(P＜0.05);西药组和电针组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠旷场实验得分比较 (±s，分)

表3 各组大鼠旷场实验得分比较 (±s，分)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与西药组比较3)P＜0.05;与电针组比较4)P＜0.05;与应激0 d比较5)P＜0.05;与应激21 d后比较6)P＜0.05

组别 n 应激0 d 应激21 d后 治疗21 d后水平 垂直 水平 垂直 水平 垂直正常组 10 35.67±16.42 4.88±2.64 24.00±7.802)3)4)5) 3.63±1.192)3)4)5) 29.88±9.372) 3.29±1.602)模型组 10 33.60±15.39 5.00±2.73 14.63±7.931)5) 1.88±1.731)5) 12.75±5.701)3)4)5)6) 1.14±1.571)3)4)5)6)西药组 10 35.70±17.65 4.57±1.40 16.11±7.521)5) 1.67±1.371)5) 24.13±7.682)6) 2.86±1.862)6)电针组 10 33.71±16.76 4.75±2.66 15.50±9.481)5) 1.71±1.501)5) 26.71±8.622)6) 2.88±1.132)6)

2.4 各组大鼠糖水消耗量比较

应激0 d，各组大鼠糖水消耗量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。应激21 d后，模型组、西药组、电针组大鼠糖水消耗量均明显降低(P＜0.05)。治疗 21 d后，西药组、电针组大鼠糖水消耗量较模型组明显升高(P＜0.05)，接近正常水平;西药组和电针组大鼠糖水消耗量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠糖水消耗量比较 (±s，%)

表4 各组大鼠糖水消耗量比较 (±s，%)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与西药组比较3)P＜0.05;与电针组比较4)P＜0.05;与应激0 d比较5)P＜0.05;与应激21 d后比较6)P＜0.05

组别 n 应激0 d 应激21 d后 治疗21 d后正常组 10 87.59±7.08 90.10±7.222)3)4) 90.49±6.042)模型组 10 88.36±6.99 79.68±9.191)5) 78.52±5.611)5)西药组 10 86.91±5.17 78.51±11.301)5) 86.32±8.462)6)电针组 10 87.94±10.06 78.59±9.181)5) 85.79±4.272)6)

2.5 各组大鼠前额叶和海马 BDNF mRNA、CREB mRNA表达量比较

治疗21 d后，模型组大鼠前额叶和海马BDNF mRNA、CREB mRNA表达量显著低于正常组(P＜0.05);西药组和电针组前额叶和海马BDNF mRNA、CREB mRNA表达量较模型组显著升高(P＜0.05);电针组前额叶BDNF mRNA表达量较正常组、模型组和西药组显著升高(P＜0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠前额叶和海马BDNF mRNA、CREB mRNA表达量比较 (±s)

表5 各组大鼠前额叶和海马BDNF mRNA、CREB mRNA表达量比较 (±s)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与西药组比较3)P＜0.05

组别 n 前额叶BDNF mRNA 海马BDNF mRNA 前额叶CREB mRNA 海马CREB mRNA正常组 6 0.92±0.192) 1.80±0.192) 1.32±0.202) 1.19±0.142)模型组 6 0.60±0.061) 1.01±0.141) 0.92±0.041) 0.92±0.091)西药组 6 0.99±0.302) 1.58±0.482) 1.14±0.071)2) 1.15±0.152)电针组 6 1.35±0.221)2)3) 1.72±0.342) 1.15±0.081)2) 1.13±0.162)

2.6 各组大鼠前额叶和海马BDNF、CREB表达量比较

治疗 21 d后，模型组大鼠前额叶和海马 BDNF、CREB的表达量显著低于正常组(P＜0.05);西药组和电针组前额叶CREB和海马BDNF、CREB的表达量较模型组显著升高(P＜0.05)，但低于正常组(P＜0.05);电针组前额叶BDNF的表达量较正常组、模型组和西药组显著升高(P＜0.05)。详见表6。

表6 各组大鼠海马BDNF、CREB表达量比较 (±s)

表6 各组大鼠海马BDNF、CREB表达量比较 (±s)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与西药组比较3)P＜0.05;与电针组比较4)P＜0.05

组别 n 前额叶BDNF 海马BDNF 前额叶CREB 海马CREB正常组 6 4199.58±400.352)4) 4844.03±546.042) 5885.75±383.992) 5929.13±149.212)模型组 6 2655.03±954.291)3)4) 2820.10±306.861)3)4) 3443.35±438.121)3)4) 2522.75±404.571)3)4)西药组 6 4697.53±358.782)4) 3710.98±115.551)2) 4584.23±404.831)2) 3412.25±414.781)2)电针组 6 5759.15±762.011)2)3) 3486.55±253.131)2) 4387.90±213.741)2) 3358.67±484.571)2)

3 讨论

卒中后抑郁的发生机制与社会心理学、基因多态性、神经递质紊乱、神经营养因子紊乱、细胞炎性因子等密切相关。其中，神经递质假说是最为广泛认可的假说之一，众多研究发现PSD患者存在5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺合成减少。目前，SSRIs是国内外公认的用于治疗 PSD的临床一线药物，盐酸氟西汀作为临床常用的SSRIs类药物，能够选择性地抑制5-羟色胺转运体，阻断突触前膜对 5-羟色胺的再摄取，使体内5-羟色胺保持较高含量，延长和增加5-羟色胺的作用，从而产生抗抑郁作用，常用于抗抑郁的对照研究中[9]。

近年来发现盐酸氟西汀在多种神经系统疾病中表现出神经保护作用。Khodanovich M等[22]发现氟西汀能够抑制脑缺血模型大鼠海马神经元凋亡，提高新生神经元存活率，改善大鼠神经功能缺损。Dhami KS等[23]发现氟西汀可增加糖氧剥夺模型损伤大鼠的皮质神经元的存活率。Mondal AC等[24]研究发现氟西汀抗抑郁的同时，使PSD大鼠特定脑区下降的BDNF水平回升至正常水平。

神经生长因子BDNF与PSD的关系是近年来研究的热点。BDNF表达水平降低，BDNF与其特异性受体TrkB介导的MAPK/ERK信号转导通路活性降低，受损和凋亡的皮层及海马神经细胞得不到充分的再生补充，导致神经可塑性下降，产生一系列抑郁症状[25]。众多研究者[26]发现BDNF和PSD存在明显的相关性。如Ifergane G等[21]发现PSD大鼠前额叶及海马BDNF表达减少，经过抗抑郁治疗后，前额叶及海马BDNF表达增多;Jin HJ等[27]证实氟西汀可以改善 PSD小鼠的抑郁样行为，并上调海马BDNF的表达。

BDNF与其特异性的高亲和力酪氨酸激酶受体 B(Tyrosine kinase receptor B， TrkB)结合后可诱导其特异位点磷酸化，激活多种蛋白和酶，将 BDNF信号传递至细胞核，启动即早基因和延迟反应基因的转录，调节BDNF的表达，为多巴胺能、胆碱能、5-羟色胺能、谷氨酸能等多种神经元提供营养支持，维持正常神经信号的传递[28]，发挥保护神经元和促进神经元再生的作用[29]。此外，BDNF可通过调控细胞因子和转录因子的表达，控制局部炎症，在缺血性损伤中起到神经保护作用[11]。CREB是一种重要的转录因子，可被多种信号通路激活，能够调节多种神经系统功能[30]。CREB被MAPK/ERK信号通路激活后，可调节相关基因的转录表达，促进BDNF表达增多[31]。

近年来，电针被广泛应用于PSD的治疗中。Li XB等[32]运用Meta分析对电针与抗抑郁药治疗PSD的疗效进行了系统评价，发现电针与抗抑郁药比较虽然疗效上无显著差异，但更安全、可靠、不良反应小。此外，有研究发现针刺可以显著改善 PSD患者抑郁症状，提高患者血清中的BDNF、CREB的表达水平[33-34]。

PSD在中医学中并未有相对应的病名，多认为其是“中风”与“郁病”的合病。卒中后情志失调，气机郁滞，痰瘀互结，耗伤气血津液，使脑神失养，神失所藏导致本病的发生。本研究选取百会、丰隆、太冲、三阴交穴进行针刺治疗。百会穴居巅顶正中，为三阳五会之所，具有醒脑开窍、祛风通络，宁心调神之功;丰隆穴为足阳明胃经络穴，善于调理脾胃功能，祛痰化湿;太冲为足厥阴肝经原穴，有调和气血、疏肝理气、平肝熄风、通经活络之功;三阴交为肝脾肾三经相交汇之处，可健脾益血、调肝补肾、安神镇惊。四穴共用，以达到行气解郁、祛痰化湿、培补肝肾、醒神开窍的功效。电针作为一种治疗手段，将现代物理电刺激与传统的经络腧穴理论相结合，既可通过低频电流刺激提高神经肌肉兴奋性，又能加强穴位的治疗作用，改善气血运行状态。

本研究采用线栓法大脑中动脉闭塞模型联合慢性不可预知温和应激抑郁症模型制备PSD模型。在应激21 d后，大鼠神经缺损情况较术后24 h减轻，但仍未恢复，肢体运动功能受损，体质量减轻，自发活动减少，对新环境探索能力减弱，糖水消耗量较少，快感缺失，表现出明显抑郁症状(P＜0.05)，提示PSD模型制备成功。经过21 d的治疗，与模型组比较，电针组和西药组大鼠肢体运动功能明显恢复，体质量有所增加，自发活动增多，对新环境探索增多，糖水消耗量增加，对奖赏反应敏感(P＜0.05)，提示电针和氟西汀均有效改善了大鼠的抑郁行为，且疗效无显著差异(P＞0.05)。

研究结果显示，模型组大鼠前额叶及海马BDNF mRNA、CREB mRNA、BDNF、CREB的表达量较正常组均减少(P＜0.05)，提示 PSD发生后，脑损伤抑制了前额叶及海马BDNF、CREB表达。电针或氟西汀干预使大鼠前额叶及海马BDNF mRNA、CREB mRNA、BDNF、CREB表达明显增多(P＜0.05)。电针较氟西汀能更显著增加前额叶BDNF mRNA及BDNF表达(P＜0.05)，对其他指标的影响与氟西汀无明显差异(P＞0.05)。结合大鼠神经缺损评分、体质量及行为学的改变，提示电针能够显著改善PSD大鼠抑郁行为，其抗PSD机制可能通过增加大鼠前额叶及海马BDNF、CREB的表达来实现。