“双固一通”艾灸法对糖尿病及糖尿病周围神经病变大鼠海马BDNF和NT-3蛋白的影响

曾林 ，向婷 ，王天沛 ，胡霞 ，唐宏图 ，4

(1.湖北中医药大学针灸骨伤学院，武汉 430061;2.中国解放军广州军区武汉总医院，武汉 430070;3.湖北中医药大学基础医学院，武汉 430065;4.针灸治未病湖北省协同创新中心，武汉 430061)

糖尿病(diabetes mellitus， DM)是胰岛素分泌的缺陷或(和)胰岛素作用障碍所导致的一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。DM以高血糖为主要标志，诱发各种严重的并发症，是DM致死、致残的主要原因[1]。DM已成为全世界许多国家的常见病和多发病，其病死率已居肿瘤、心血管病之后的第3位，是工业发达国家中仅次于癌症、艾滋病和心血管疾病之后需优先考虑的疾病[2]。据国家卫生部调查显示，我国每天新增 DM患者3000例，每年约增加120万[3]。糖尿病周围神经病(diabetic peripheral neuropathy， DPN)是 DM 常见并发症，近年来，随着DM发病率的提高，其周围神经病变的发病率也明显增多。据统计，DPN的发生率高达60%～90%[4]。有相关研究表明，糖尿病患者体内缺乏神经营养因子及其相关受体，从而导致了 DPN的发生[5]。而且另有学者指出，神经营养因子在神经修复的过程中起着重要作用[6]，因此缺乏此类因子也是多数神经损伤不可逆转的主要原因之一。本实验通过对DM、DPN大鼠血糖及其海马组织的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)和神经营养素-3(neurotrophin-3， NT-3)蛋白表达的观察，拟探讨艾灸对防治DM及DPN的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择的 SPF级雄性 SD大鼠 105只，体质量为(200±20)g(3月龄)，实验动物由湖北中医药大学实验动物中心[实验动物许可证号 syxk(鄂)2017-0067]提供。适应性喂养1周，再行实验，实验过程完全符合《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2 主要试剂及仪器

链尿佐菌素(S0130，Sigma公司，美国)，BDNF抗体(ab108319，Abcam 公司，美国)，NT3 抗体(ab216491，Abcam公司，美国)，KD-YS3A生物组织自动脱水机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)，KL-Ⅰ型生物组织自动包埋机(湖北康龙电子科技有限责任公司)，Finesse325旋转石蜡切片机(美国赛默飞世尔科技有限公司)，BX53型生物显微镜(日本奥林巴斯公司)，AWL-1001-M艾科浦超纯水机(美国艾科浦国际有限公司)，动物实验用艾条(河南南阳汉方艾叶有限公司)，ONE TOUCH稳豪®倍易型血糖仪(美国强生公司)，HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)。

1.3 模型制备

采用随机数字表法随机选取 15只大鼠作为正常对照，另90只大鼠禁食不禁水12 h后，左下腹腔注射链脲佐菌素[7]，剂量为 50 mg/kg体质量。注射完成后72 h开始测血糖，凡血糖水平在16.7 mmol/L以上者列为DM模型大鼠[8]。

1.4 实验分组和处理

从造模成功的75只DM模型大鼠中采用随机数字表法随机抓取30只，并再次采用随机数字表法均分为B组和C组，每组15只;剩余45只DM模型大鼠继续正常喂养4周，测定感觉或运动传导速度减慢超过11%即成DPN大鼠模型[9]，共30只，再采用随机数字表法随机均分为D组和E组，每组15只。

A组:正常对照，不造模，不治疗。

B组:DM模型组，造模成功后不行艾灸治疗，正常喂养。

C组:DM艾灸治疗组，造模成功后，取大鼠关元，双侧足三里、胰俞穴[10]，用0.5 cm×15 cm的实验动物用艾条对各穴位先后进行悬灸，艾条距离穴位约5 cm，每穴15 min，每日1次，连续治疗4周后取材检测。

D组:DPN模型组，不行艾灸治疗，正常喂养。

E组:DPN艾灸治疗组，治疗方法同C组。

1.5 指标观察与检测

1.5.1 血糖检测

于造模后72 h、4周治疗结束后和8周治疗结束后空腹尾静脉采血，用强生血糖仪及配套试纸检测血糖。

1.5.2 BDNF和NT-3蛋白免疫组化检测

4周治疗结束后和8周治疗结束后，用10%水合氯醛将各组大鼠麻醉，迅速断头取大脑，剥离海马部分置于4%的多聚甲醛固定液中固定。常规石蜡包埋、切片，贴片后于60℃烘片3 h备用。

免疫组化DAB法检测海马组织BDNF和NT-3蛋白的表达水平，具体步骤为脱蜡，PBS浸洗3 min×3次，用微波辐射抗原修复法进行抗原修复，而后等待其自然降至常温，用 0.3%过氧化氢甲醇液阻断内源性过氧化物酶，PBS浸洗 5 min×3次，10%正常山羊血清室温封闭10 min，甩去血清滴加1:250倍稀释的兔抗BDNF、NT-3单/多克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS浸洗5 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗IgG多聚体，37℃孵育45 min，PBS浸洗5 min×3次。用新鲜配制的DAB显色液显色，在显微镜下控制显色时间，用PBS终止反应，苏木素复染，盐酸酒精分化，水洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片晾干，镜检拍照。图片分析采用 HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统进行图像分析。每鼠取切片5张，400倍镜下检测各片的平均光密度值(density)，分别测定，累加取其平均值，即为该鼠density值。终值单位为像素点，检测场面积为15万个像素点。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS19.0统计软件进行处理。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，各组治疗前后比较运用配对样本t检验，组间比较运用单因素方差分析。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠治疗前后血糖比较

B组、D组与 A组比较，血糖水平明显升高(P＜0.05);C组与B组比较，大鼠在治疗后血糖水平均降低(P＜0.05);E组与D组比较，大鼠在治疗后血糖水平均降低(P＜0.05)，详见表1。

表1 各组大鼠治疗前后血糖比较 (±s，mmol/L)

表1 各组大鼠治疗前后血糖比较 (±s，mmol/L)

注:与A组比较1)P＜0.05;与B组比较2)P＜0.05;与D组比较3)P＜0.05

组别 n 72 h 4 w 8 w A 组 15 4.78±0.83 5.14±1.08 5.08±0.93 B组 15 19.23±1.421) 23.25±2.181) -C组 15 21.34±2.061) 13.68±2.891)2) -D 组 15 21.73±3.151) 23.58±2.191) 26.39±2.371)E 组 15 20.65±2.721) 22.46±3.481) 13.87±2.571)3)

2.2 各组大鼠海马组织BDNF蛋白表达比较

正常大鼠海马BDNF蛋白阳性表达呈棕色，B组和D组大鼠阳性表达均减少，经“双固一通”灸法防治后，C组和E组大鼠的BDNF蛋白阳性表达均明显增加，详见图1。

图1 各组大鼠海马组织BDNF蛋白表达比较(×400)

表2 各组大鼠BDNF免疫阳性神经元平均光密度值比较(±s，OD/mm2)

表2 各组大鼠BDNF免疫阳性神经元平均光密度值比较(±s，OD/mm2)

注:与A组比较1)P＜0.05;与B组比较2)P＜0.05;与D组比较3)P＜0.05

组别 n 4 w 8 w A组 15 24.36±0.15 24.87±0.34 B组 15 12.16±0.081) -C组 15 18.52±0.432) -D组 15 - 9.56±1.321)E组 15 - 16.58±0.643)

B组、D组大鼠海马BDNF免疫阳性神经元平均光密度值较A组明显减少(P＜0.05);与B组比较，C组大鼠 BDNF免疫阳性神经元平均光密度值明显增加(P＜0.05);与D组比较，E组大鼠BDNF免疫阳性神经元平均光密度值明显增加(P＜0.05)，详见表2。

2.3 各组大鼠海马组织NT-3蛋白表达比较

正常大鼠NT-3蛋白阳性表达呈棕色，B组和D组大鼠阳性表达均减少，经“双固一通”灸法防治后，C组和E组大鼠的NT-3蛋白阳性表达均明显增加，详见图2。

图2 各组大鼠海马组织中NT-3蛋白表达比较(×400)

B组、D组大鼠海马NT-3免疫阳性神经元平均光密度值较A组明显减少(P＜0.05);与B组比较，C组大鼠 NT-3免疫阳性神经元平均光密度值明显增加(P＜0.05);与D组比较，E组大鼠NT-3免疫阳性神经元平均光密度值明显增加(P＜0.05)，详见表3。

表3 各组大鼠NT-3免疫阳性神经元平均光密度值比较(±s，OD/mm2)

表3 各组大鼠NT-3免疫阳性神经元平均光密度值比较(±s，OD/mm2)

注:与A组比较1)P＜0.05;与B组比较2)P＜0.05;与D组比较3)P＜0.05

A组 15 38.56±0.05 38.34±0.32 B组 15 11.32±0.061) -C组 15 24.51±0.232) -D组 15 - 8.68±0.821)E组 15 - 20.36±0.583)

3 讨论

中医学将糖尿病(DM)称之为“消渴”。糖尿病周围神经病(DPN)在古医籍中无确切的病名，但长期以来DPN与“消渴”都是密切联系在一起的。《黄帝内经》时期已对消渴的病因、病机、症状等有了较为详细的记载。《内经》明确地指出消渴病因为“此肥美之所发也，引人必数食甘美多肥也。肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”，这些论述与现代医学研究认为饮食失控可诱发糖尿病的理论十分吻合。唐初著名医家甄立言《古今录验方》记载消渴临床症状为“渴而饮水多，小便数，无脂似麸片甜”，王焘在《外台秘要》中指出“消渴者，每发小便至甜”。《素问·太阴阳明论》:“脾病不能为胃行其津液，四肢不得禀水谷之气，气日以衰，脉道不利，筋骨肌肉皆元气以生。”说明 DPN的临床表现是以四肢麻木不仁为主;而脾虚化生津液不足，营阴亏耗，从而引起气血亏虚，不能濡养筋脉而导致四肢不温而痛;气虚血行不畅，久而成瘀。

中医学“治未病”以正气为本，固护先天和后天是其基础和关键，通过“治”达到“防”的目的，“治”是积极的、主动的“防”。“防”的意义有三，一是预防疾病，二是疗疾防变，三是调节机能。中医学“治未病”的本质特征是“固护正气、以治为防”[11]。“双固”即固护人体先天之本和后天之本，“一通”即通泻病邪。足三里为胃经合穴，胃腑之下合穴，针之可调理脾胃，补益气血生化之源，固护后天之本;关元为任脉腧穴，也是三阴经与任脉交会穴，为元阴、元阳关藏出入之所，针之可益精补气，扶助人体先天之本。足三里、关元配合，兼顾先天和后天，补益正气，再与治疗消渴的效穴胰俞相配伍，则可达到以治为防、防微杜渐的目的[12]。“双固一通”针灸法以中医发病学和防治学理论为基础，坚持“未病先防，既病防变”的治疗原则，注重调动机体整体的潜在能力，以治为防，防治结合[13]。

灸法在对 DM及其并发症的防治方面也有极为丰富的记载。古文献《千金翼方》载:“消渴咽喉干，灸胃管下俞三穴各百壮，穴在背第八椎下横三寸，间寸灸之。”又有“食不充饥灸三里”之说。在现代临床研究方面，对DPN患者采用雷火灸法[14-15]、温针灸[16]可明显改善患者的生活质量。也有学者发现，在治疗 DPN上，运用温和灸治疗后患者空腹血糖、糖化血红蛋白、一氧化氮、丙二醛和血浆内皮素均有明显改善，且与西药组有明显差异[17]。亦有报道称通过温针灸法可以显著改善DPN患者中医证候积分、Toronto量表评分，提高神经传导速度[18]。在现代动物实验方面，赵永等[19]观察到“双固一通”灸法可对模型大鼠的血清中的TNF-α和 IL-6的含量起到良性调节的作用。另有学者[20-21]研究表明艾灸可更有效地清除自由基，发挥胰岛素(INS)的作用，改善患者的代谢状态。

神经营养因子(neurotrophic factors， NTFs)是一类在靶组织内合成，并逆行运输至效应神经元的能对中枢和周围神经发挥营养作用的小分子肽类物质和蛋白质[22]。而NTFs的缺乏被认为是DPN的发生的主要原因[23]。在神经营养因子家族中神经生长因子(NGF)研究较多，其功能为维持神经的功能和形态、修复神经损伤，还能促进胰岛的正常发育和功能维持，当DPN发生时，体内 NGF水平下降，引起神经轴突运转异常，影响神经正常功能[24]。近来发现脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养素-3(NT-3)对中枢和周围神经组织有广泛作用，对神经元发育有促进作用，并能使受损神经元免于凋亡[25]。BDNF和NT-3是神经营养因子家族中重要成员，它们与NGF有50%同源性[26]。BDNF对在体运动神经元发育、成年后运动神经元存活及病变运动神经元存活和轴突再生有着十分重要的作用[27-30]。李昌琪等[31]在小鼠坐骨神经压榨损伤后，腹腔注射 BDNF抗体中和内源 BDNF，证实了小鼠坐骨神经损伤后内源性BDNF可参与脊髓前角运动神经元内突触素Ⅰ mRNA表达的调节。张力等[32]也发现内源性BDNF对周围神经的再生和髓化起重要作用。在Wobler小鼠模型中(运动神经元疾病)，外源性BDNF可阻滞运动功能失调，并减少去神经支配的肌肉萎缩和运动神经元轴突的丢失。因此，BDNF在受损运动神经元的修复中起重要作用[33]。NT-3主要分布在大脑海马，在骨骼肌中也大量存在，对支配肌肉的感觉神经元和运动神经元都发挥着营养作用。NT-3可以调节神经元的活动以及促进损伤神经的修复，NT-3缺乏或含量不足时，会对学习记忆等功能产生影响，并与阿尔茨海默病等神经退行性病变密切相关。以往的许多研究已证实DM可以引起周围神经系统NT-3合成和运输下降[34]。NT-3能够促进神经元存活，阻止神经元损伤后死亡，促进神经元修复和调节神经递质传递等功能，并可以逆转受损神经元的萎缩，使损伤部位存活的神经元增多[35]。

本实验结果显示，通过“双固一通”艾灸法治疗后，模型大鼠的血糖明显下降，发挥了其降糖的作用，而且发现模型组大鼠海马中BDNF和NT-3蛋白表达的数量明显降低，DM及 DPN严重损伤了大鼠神经功能;而 DM和DPN治疗组中，二者BDNF和NT-3蛋白的表达显著增加，因此，“双固一通”艾灸法通过影响BDNF和NT-3的产生，保护糖尿病大鼠的感觉神经元，对糖尿病及并发症周围神经病变起到治疗作用。