夹脊电针结合BWSTT干预脊髓损伤大鼠髓鞘超微结构及p-MLC的研究

何克林 ，胡蓉 ，马睿杰 ，

(1.浙江中医药大学附属第三医院，杭州 310000;2.浙江中医药大学，杭州 310053)

脊髓损伤是一种破坏性极大的中枢神经系统疾病，由于脊髓结构受到破坏，导致神经冲动无法向下传递，从而出现运动功能障碍。近年来，随着社会的快速发展，外伤性脊髓损伤的发病率有不断上升的趋势[1]。脊髓损伤后运动功能出现障碍，使患者瘫痪在床，无法活动，给患者和家庭带来极大的压力。在临床上，电针对脊髓损伤具有较好疗效[2]，减重步行训练(body weight support treadmill training， BWSTT)是通过减轻脊髓损伤的下肢负重，以便更早地参与功能锻炼的一种康复运动疗法[3]。本研究通过制备外伤性脊髓损伤大鼠模型，探讨电针联合 BWSTT对磷酸化肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain， p-MLC)和中枢髓鞘来源的神经生长抑制受体(Nogo-66 receptor，NGR)表达及髓鞘超微结构的影响以及运动功能恢复的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本实验动物委托浙江中医药大学动物实验中心购买[动物合格证书 SCXK(沪)2013-0016]。将 60只 SD成年雄性大鼠，体质量(200±20)g，编号1～60并导入SPSS软件进行随机分组，分为正常组、模型组、电针(EA)组、药物组和 EA＋运动组，每组 12只，每组有连续治疗7 d和14 d的2个亚组，每个亚组均有6只SD大鼠。本实验严格遵守科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要实验仪器与试剂

NYU脊椎冲击损伤仪(美国健康医疗仪器国际公司型号NYU-2);冰冻切片机(microm HM550， Thermo);恒温水箱(DK-600S型，上海精宏实验设备有限公司);Mini-PROTEAN垂直电泳和转膜系统(美国 Bio-Rad);华佗牌针灸针(0.18 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司);HANS穴位神经刺激仪(HANS100A，南京济生医疗科技有限公司);蛋白紫外分光光度计(德国Eppendorf);凝胶成像系统(Image Quant LAS4000型，德国 GE 公司);p-MLC(ab2480，美国 Abcam);NGR(ab174323，美国 Abcam);β-actin(ab179467，美国Abcam);BCA蛋白定量试剂盒(P0018，上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 模型制备

所有SD大鼠适应性饲养1周后，正常组仅手术切除椎板，不造成脊髓损伤，其余 4组均采取改良的Allen法制备脊髓损伤模型[4]。具体方法如下，将大鼠麻醉后俯卧位放置在恒温动物台上，先将SD大鼠四肢固定，再用手术切除大鼠脊柱 T10节段椎板，充分暴露脊髓，然后放置在美国NYU脊椎冲击损伤仪上，参数设置为5 g×10 cm，通过下落的短杆垂直撞击脊髓，造成脊髓组织的损伤。术后用脊髓损伤行为学评分(Basso-Beattie-Bresnahan rating scale， BBB 评分)评估造模成功与否，BBB评分在 3分以下的为造模成功。

1.4 治疗方法

正常组和模型组仅常规观察。

EA组选用华佗牌针灸针，取损伤部位的上下节段的夹脊穴，针刺深度以针尖触及椎板为度，以同侧上下夹脊穴为1组，连上韩式电针仪，设置频率为2/100 Hz，留针20 min。每日治疗1次。

药物组予腹腔注射法舒地尔(Fasudil)[5]，剂量为10 mg/kg。每日治疗1次。

EA＋运动组采用夹脊穴电针联合 BSWTT进行干预。电针取穴、参数及方法同EA组。BSWTT具体流程是将减重装置架设在活动平板(T1501)上，再将 SD大鼠放在活动平板上，分别用减重装置上的前部夹子夹住大鼠的项背部皮肤，后部夹子夹住大鼠背部近鼠尾处，提起大鼠但不脱离活动平板，以减轻大鼠后肢负荷，然后启动活动平板让大鼠后肢随平板转动而进行步行训练，活动平板的速度为8 m/min，每日减重步行训练2次，每次训练时间为5 min。

1.5 指标检测

1.5.1 BBB评分

采用 BBB评分[6]观察脊髓损伤大鼠的后肢运动功能恢复情况。连续治疗7 d和14 d后，将脊髓损伤大鼠放进旷场，先让大鼠适应性的爬行15 min，对照BBB评分表，通过观察脊髓损伤大鼠后肢各关节的细微活动、步态以及精细运动情况进行评分，各时间点重复评估3次，每次评估间隔30 min，取3次BBB评分的平均值。

1.5.2 Western blot检测

运用免疫印迹法检测p-MLC和NGR的表达。大鼠麻醉后，手术分离损伤段脊髓，取脊髓组织称重后置于缓冲液中，低温匀浆，离心取上清液，用 Loary法测定蛋白含量，用于免疫印迹检测。将提取的脊髓组织蛋白(50 μg)加2×SDS上样缓冲液经变性10 min，上样于8% SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳2 h后转膜，将膜与一抗p-MLC(1:1000)、NGR(1:1000)结合，放入4℃冰箱孵育过夜，然后与二抗(1:5000)结合，于室温条件下孵育1 h，显色压片后使用Bandscan5.0软件分析条带的光密度值，每个条带重复测量3次。目标蛋白的相对表达=目的蛋白(光密度值)/内参β-actin(光密度值)。

1.5.3 髓鞘染色

用髓鞘染色(luxol fast blue stain， LFB染色)观察脊髓损伤大鼠的髓鞘结构。各组大鼠取脊髓组织制作冰冻切片，经蒸馏水清洗后，放入0.1% LFB溶液，于 60℃密封过夜，再次用蒸馏水、95%乙醇清洗，放入碳酸锂溶液30 s，70%乙醇30 s。直至显微镜下观察灰、白质区分清晰为止。再用蒸馏水冲洗，甲苯酚紫复染30～40 s，再次用蒸馏水冲洗，95%乙醇 5 min(镜检)，100%乙醇2×5 min，二甲苯2×5 min，中性树胶封片观察。

1.6 统计学方法

采用SPSS21.0软件处理和分析，符合正态分布的数据用均数±标准差表示。各组组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐时，两两比较用最小显著差法(LSD-t)检验;若方差不齐，则采用Dunnett’s检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BBB评分

脊髓损伤后大鼠后肢运动功能明显减弱，BBB评分结果显示，治疗7 d后，EA＋运动组BBB评分与模型组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。治疗 14 d后，EA＋运动组BBB评分较前升高，与模型组和EA组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠治疗后7 d、14 d BBB评分比较 (±s)

注:与正常组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与EA组比较3)P＜0.05;与药物组比较4)P＜0.05

组别 n 治疗7 d后 治疗14 d后正常组 12 21±0 21±0模型组 12 1.83±1.171) 8.00±0.891)EA组 12 5.83±0.751)2) 12.17±1.321)2)药物组 12 8.33±1.031)2)3) 14.67±1.211)2)3)EA＋运动组 12 6.83±1.161)2)4) 14.00±1.091)2)3)

2.2 p-MLC蛋白表达

脊髓损伤后大鼠 p-MLC表达明显增多，治疗 7 d后， EA＋运动组p-MLC表达与模型组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。治疗14 d后，EA＋运动组p-MLC表达较前减少，与模型组和 EA组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表2、图1。

表2 各组大鼠治疗后7 d、14 d p-MLC表达比较 (±s)

表2 各组大鼠治疗后7 d、14 d p-MLC表达比较 (±s)

注:与正常组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与EA组比较3)P＜0.05;与药物组比较4)P＜0.05

组别 n 治疗7 d后 治疗14 d后正常组 12 0.17±0.07 0.16±0.08模型组 12 2.01±0.201) 1.69±0.161)EA组 12 1.17±0.141)2) 0.81±0.051)2)药物组 12 0.84±0.071)2)3) 0.67±0.051)2)3)EA＋运动组 12 1.02±0.141)2)4) 0.62±0.051)2)3)

图1 各组大鼠治疗后7 d、14 d p-MLC的表达

2.3 NGR蛋白表达

脊髓损伤后NGR表达明显增多，治疗7 d后，EA＋运动组 NGR表达与模型组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。治疗14 d后，EA＋运动组NGR表达较前减少，与模型组和 EA组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表3、图2。

表3 各组大鼠治疗后7 d、14 d NGR表达比较 (±s)

表3 各组大鼠治疗后7 d、14 d NGR表达比较 (±s)

注:与正常组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与 EA组比较3)P＜0.05;与药物组比较4)P＜0.05

组别 n 治疗7 d后 治疗14 d后正常组 12 0.12±0.03 0.13±0.06模型组 12 1.18±0.161) 1.15±0.081)EA组 12 0.94±0.161)2) 0.86±0.091)2)药物组 12 0.70±0.051)2)3) 0.65±0.071)2)3)EA＋运动组 12 1.02±0.151)2)4) 0.77±0.071)2)3)4)

图2 各组大鼠治疗后7 d、14 d NGR的表达

2.4 LFB染色

脊髓损伤后，轴突髓鞘结构遭到破坏，脊髓白质纤维紊乱，髓鞘缺失，有髓神经纤维较少，髓鞘染色平均IOD值下降明显。治疗7 d后，EA＋运动组平均IOD值与模型组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，治疗14 d后，EA＋运动组平均IOD值较前升高，与模型组和EA组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表4、图3。

表4 各组大鼠治疗后7 d、14 d LFB染色表达比较(±s)

表4 各组大鼠治疗后7 d、14 d LFB染色表达比较(±s)

注:与正常组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与 EA组比较3)P＜0.05

组别 n 治疗7 d后 治疗14 d后正常组 12 7226.52±574.42 6915.04±278.82模型组 12 3830.76±458.251) 3923.02±274.931)EA组 12 4824.98±316.371)2) 5030.47±575.331)2)药物组 12 5341.76±218.091)2)3) 5690.89±451.951)2)3)EA＋运动组 12 4888.84±237.861)2) 5655.58±313.231)2)3)

图3 各组大鼠治疗后7 d、14 d髓鞘染色(×400)

3 讨论

3.1 中医学对脊髓损伤的认识

脊髓损伤后可见下肢痿弱无力，影响随意运动。中医学将其归属于“痿证”范畴，相关描述最早可见于《灵枢·寒热病》:“身有所伤……若有所堕坠，四肢懈惰不收，名曰体惰。”脊髓是督脉循行之处，督脉主人体一身之阳气，外力撞击致脊髓结构形变，则督脉受损，瘀血阻络，督脉之气血运行不利，则肢体失养，发为痿证。治疗上，需疏通瘀阻之督脉，促进督脉气血运行，肢体得以气血濡养，则痿证向愈。夹脊穴内夹督脉，可疏通督脉之气血，使督脉之气能上下贯通。

3.2 夹脊电针结合 BWSTT对脊髓损伤运动功能的作用

脊髓损伤后运动功能遭到破坏，导致患者瘫痪在床，长此以往，会进一步出现一系列并发症。夹脊穴位于脊神经的后支上，多项研究证实夹脊穴电针可促进脊髓损伤后运动功能的恢复[7-9]。减重步行训练是一种运动疗法，可用于脊髓损伤后下肢功能恢复[10-12]。由于脊髓损伤后，患肢肌力明显下降，还不能支撑自身重力，满足行走需要。减重步行训练通过减轻下肢负重，可让患者更早地参与行走。BBB评分是评价大鼠后肢运动功能恢复的常用指标，广泛应用脊髓损伤后肢体运动功能的评估[13-14]。本实验研究通过电针结合BWSTT，BBB评分结果显示，在连续治疗14 d后，EA＋运动组的BBB评分优于EA组，说明二者联合应用能促进运动功能恢复。

3.3 电针结合BWSTT对脊髓损伤大鼠MLC磷酸化调节

肌球蛋白轻链(myosin light chains， MLC)是RhoA/ROCK信号的下游底物，RhoA/ROCK信号激活后能对下游底物 MLC磷酸化，刺激肌球蛋白与肌动蛋白的交联，进而增强肌动蛋白的收缩，调节细胞骨架的重组，导致生长锥塌陷，神经元突起缩回，使轴突的生长受到抑制[15]。NGR是位于胞膜外的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，中枢髓鞘来源的神经生长抑制因子均需要与NGR结合，发挥抑制髓鞘生成的作用[16-17]。Fasudil是ROCK激酶抑制剂，具有竞争性拮抗作用，与ATP位点结合，抑制ROCK激酶活性，调节MLC和NGR的表达，促进轴突再生和神经功能恢复[18-20]。本研究发现，脊髓损伤后，p-MLC、NGR表达均明显增多，电针结合BWSTT组的MLC磷酸化较模型组表达少，说明电针结合BWSTT可能通过抑制ROCK活性，进而减少MLC磷酸化和中枢髓鞘来源的神经生长抑制因子受体NGR的表达。

3.4 电针结合 BWSTT对脊髓损伤大鼠髓鞘超微结构的影响

髓鞘结构是神经元轴突表面包裹的富含脂类的多层质膜，可调节神经元的传导速率，维持神经系统的稳定性，以及运动、认知及情感等高级神经功能具有重要作用[21-23]。脊髓损伤后，神经元轴突脱髓鞘性改变，神经传导受到影响，运动功能遭到破坏。本研究发现，脊髓损伤后，脊髓白质纤维紊乱，髓鞘缺失，有髓神经纤维较少，髓鞘染色平均IOD值下降明显，说明髓鞘参与脊髓损伤后神经功能恢复，电针＋运动组的髓鞘染色平均IOD值较模型组增多，说明电针结合BWSTT能干预髓鞘再生，促进脊髓损伤后神经功能恢复。在治疗14 d后，电针＋运动组的髓鞘染色平均 IOD值优于 EA组，提示随着治疗时间的延长，电针结合 BWSTT更具有优势。

综上，电针结合 BWSTT可能通过抑制脊髓损伤后MLC的磷酸化及中枢髓鞘来源的神经生长抑制受体NGR的表达，保护髓鞘结构，促进运动功能恢复。