葛根素对富血小板纤维蛋白环境下MC3T3-E1成骨细胞生物学性能的影响

杨忠学 张云涛 张宇 乔鲁卉 侯玉东

256600,滨州医学院附属医院口腔修复科

富血小板纤维蛋白(PRF)制取[1]自自体血，无毒性、无免疫原性，富含高浓度的生长因子(PDGF、TGF、IL-4等)能够有效促进成骨细胞的增殖分化[2]。葛根素作为一种植物雌激素(异黄酮类衍生物)，近年来研究发现葛根素能够抑制骨吸收防止骨质疏松[3]和影响成骨细胞的增殖和分化[4]，在多名学者的研究[4-6]中发现单纯葛根素对成骨细胞作用时，最佳浓度区间基本趋于10-8～10-6mol/L。但是其对骨结合的影响机制尚有争议。本实验通过观察葛根素在PRF环境培养下对成骨细胞生物学性能的影响，探讨葛根素与PRF可能的协同作用，为临床骨增量手术提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 PRF的制备

采志愿者自体血，按文献[7]方法制备PRF并以α-MEM 培养基浸泡保存。

1.2 CCK8比色法检测细胞增殖

常规培养MC3T3-E1，重悬后以 3×104个/ml 接种于预先铺展PRF的96 孔板，1、4、7 d 加入CCK-8混合液，测定A值。

1.3 碱性磷酸酶(ALP)活性检测

将细胞钙化诱导后，按ALP说明测定1、4、7 d A值。

1.4 RT-qPCR 检测细胞Runx2 mRNA表达

将细胞成骨诱导。7 d后提取总RNA并逆转录 cDNA。选择20 μl 体系进行PCR扩增(引物序列见表1)，随后实时定量PCR测定相关基因。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.5 罗丹明-鬼笔环肽染色

制作细胞爬片，钙化诱导培育24 h。激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架与PRF纤维束形态。

1.6 钙化结节茜素红染色

细胞钙化诱导，培养21 d，待无定形物质形成后取出培养板，茜素红染色，镜下观察拍照。

2 结 果

2.1 不同浓度葛根素对PRF环境细胞增殖的情况

CCK-8比色显示：实验组干预能有效提高细胞增殖活动(图1)。

图1 MC3T3-E1细胞增殖曲线

2.2 碱性磷酸酶(ALP)活性测定

ALP结果显示：在葛根素(RPF)的影响下，细胞ALP相对活性增高(图2)。

2.3 钙化结节茜素红染色

成骨诱导21 d天后，以10-7mol/L 组钙化小结密度最高(图3)。

图2 MC3T3-E1细胞的ALP活性(①:与1 d相比较,P<0.05；②:与4 d相比较,P<0.05；③:与1 d的PRF浓度10-6 mol/L组相比，P<0.05)

2.4 Runx2 mRNA的表达

在相同时间点，各实验组与对照组相比对Runx2 mRNA的表达均有一定的促进作用(图4)。

2.5 细胞骨架形态与PRF纤维染色

图3 各组MC3T3-E1细胞钙化结节形成观察(茜素红染色，× 200)

图4 各组MC3T3-E1细胞中Runx2 mRNA的表达(①:与对照组相比,P<0.05；②:与PRF组相比,P<0.05；③:与PRF浓度为10-8 mol/L组相比，P<0.05)

如图5所示，阴性对照组中MC3T3-E1细胞铺展面积较小，细胞肌动蛋白纤维模糊。10-7mol/L葛根素(PRF)组中，细胞数量最多，细胞体积最大，细胞伸展范围最广，可以清晰的看到细胞骨架呈网格状铺展在PRF纤维束中(图5)。

3 讨 论

种植修复是目前牙列缺损及牙列缺失的最优选择，解决骨量不足的问题也变成了我们关注的重点[8]。PRF是一高效经济且安全的骨增量辅助方法。但就其临床使用方面，单独使用或与骨粉联合使用最为常见[9]，与药物混合使用的方案较少。而近年研究发现：葛根素具有一定的成骨作用。

葛根素作为一种植物雌激素(异黄酮类衍生物)，能够抑制骨吸收防止骨质疏松且能够促进成骨细胞的增殖与分化。本研究表明在PRF环境下，不同浓度的葛根素在短期内皆能促进MC3T3-E1前成骨细胞的增殖，本实验中以10-7mol/L葛根素(PRF)组为最优，但就PRF组与低浓度组(10-8mol/L)的增殖曲线变化趋势，可能与PRF中生长因子的缓释与药物浓度过低有关，有待后续的实验进一步研究。

图5 各组MC3T3-E1细胞的细胞骨架形态(激光扫描共聚焦显微镜，× 400)

ALP作为成骨细胞外酶，其活性表达是成骨细胞分化的一个显著指标。本研究结果表明，在PRF环境下，各浓度的葛根素对ALP的表达均有一定的促进作用，Zhan等[10]研究中不同浓度葛根素对MC3T3-E1的ALP表达的结果与本研究基本一致，且各浓度组均与阴性对照组有统计学差异。并在茜素红染色中均可看到在PRF环境下加入了不同浓度的葛根素后，矿化结节的增多，显示出新骨生成能力增强[11]。

Runx2是成骨细胞早期分化过程中的重要基因，在本研究表明，在PRF环境下不同浓度的葛根素均可促进Runx2的表达，且均与空白对照组、阴性对照组有统计学差异。在PRF与葛根素的共同作用下，能够促进成骨细胞早期分化与骨矿化。

成骨细胞中以肌动蛋白为主要成分的细胞骨架对于维持细胞形态，以及在种植体表面依附和伸展具有重要意义[12]。本研究观察到MC3T3-E1前成骨细胞在PRF纤维束中的附着。且随葛根素浓度的变化，细胞的形态、体积、内部架构、依附程度都发生变化，以10-7mol/L葛根素(PRF)组最佳，细胞体积大、内部架构清晰、依附程度较好。

骨结合与骨增量是口腔种植修复中的重要环节，在PRF环境下葛根素可以有效促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化、伸展与粘附，提高成骨相关基因Runx2的表达水平。可以为临床使用提供一种新的思路，在PRF环境下葛根素最佳浓度还有待进一步研究。