基于线粒体COⅠ基因序列的江苏省4个太湖新银鱼群体遗传多样性分析

李大命，唐晟凯，刘燕山，谷先坤，刘小维，殷稼雯，王 彬，马 昊，张彤晴，潘建林

（江苏省淡水水产研究所，江苏省内陆水域渔业资源重点实验室，南京 210097）

太湖新银鱼（Neosalanx taihuensisChen，1956）隶属于鲑形目（Salmoniformes）银鱼科（Salangidae）新银鱼属，为1年生小型鱼类，具有很高的营养价值，主要分布在我国黄河、淮河和长江中下游及其附属湖泊，是我国重要的经济鱼类［1］。太湖新银鱼生活周期短、生长快、世代离散，对环境变化敏感，种群波动显著，是典型的r-对策生物［2］。多年来，受围湖造田、过度捕捞、环境污染和生境破碎化等多种因素的影响，我国的太湖新银鱼天然资源持续衰退，分布范围显著缩小，保护和恢复太湖新银鱼种质资源成为亟待解决的问题［2］。

遗传多样性是生物多样性的核心和重要组成部分，了解和掌握生物的遗传多样性是制定物种保护策略的前提。只有在了解种群的遗传背景和现有的遗传格局及成因的基础上，才能为制定物种保护策略提供科学依据［3-4］。线粒体DNA具有结构简单、母系遗传、进化速率快、几乎不发生重组等特点，成为研究种群遗传多样性的常用分子标记之一［5］。其中，细胞色素c氧化酶亚基 I（cytochrome oxidase subunit I，COⅠ）序列长度适宜，进化速度较快，密码子的保守性高且引物的通用性强，其不仅适合于种群水平遗传多样性的检测，也可用于种间分析，被广泛应用于鱼类的分子系统学和种群遗传学研究［6-8］。

江苏省位于长江、淮河下游，湖泊众多，是我国银鱼资源的重要分布区域。太湖、洪泽湖、高邮湖和骆马湖是江苏省的四大淡水湖泊。历史上，四大淡水湖泊银鱼资源丰富，不仅是湖泊渔业生产的重要捕捞对象，也曾是出口创汇的重要水产品，但近年来银鱼资源逐渐趋于枯竭［9］。我国在包括太湖新银鱼在内的银鱼科鱼类的形态学、个体生物学及生态学方面已进行了广泛的研究［1-2］，但相关的遗传学资料较少。已有文献报道利用线粒体Cytb、COⅠ等分子标记分析我国太湖新银鱼的遗传多样性和遗传结构［10-11］。目前，太湖、洪泽湖的银鱼遗传多样性已有报道［12-15］，但尚未见有关高邮湖和骆马湖的银鱼遗传多样性研究。本文选用COⅠ基因作为分子标记，利用PCR扩增和测序技术，全面分析和比较江苏省太湖新银鱼种群的遗传多样性水平，探究太湖新银鱼种群的遗传结构特征。研究结果一方面有利于丰富太湖新银鱼的遗传学资料，掌握太湖新银鱼遗传资源现状；另一方面可以为太湖新银鱼种质资源管理保护和开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

2018年8月至12月利用拖网采集太湖、高邮湖、洪泽湖和骆马湖的太湖新银鱼野生群体，其中太湖群体38尾样本，高邮湖群体40尾样本，洪泽湖群体40尾样本，骆马湖群体35尾样本，共153尾样本（图1）。剪取太湖新银鱼肌肉组织，放入1.5 mL离心管中，加入无水乙醇保存，带回实验室备用。

1.2 DNA提取、PCR扩增与测序

采用Takara公司的基因组DNA提取试剂盒提取太湖新银鱼基因组DNA，将DNA溶于TE溶液中。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性，用核酸蛋白定量仪检测其浓度。

扩增COⅠ序列的正向引物为：F1（5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′），反 向引物为：R1（5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAA TCA-3′）［16］。PCR扩增体系为50μL，Taq酶混合液25μL，上下游引物各2μL（10μmol），DNA模板（40 ng·μL-1）2μL，用 ddH2O补足至 50μL。PCR扩增条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，30个循环；72℃最后延伸10 min。

用1.5%的琼脂糖凝胶检测PCR产物，凝胶成像系统拍照。PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，测序采用与PCR反应相同的引物。

图1 样本采集地点Fig.1 M ap of sampling locations

1.3 数据分析

采用BioEdit 7.0软件［17］对测序结果进行编辑和同源比对。采用 DnaSP 5.0软件［18］统计核苷酸变异位点、单倍型数目、单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数。

利用MEGA 7.0软件［19］统计序列的碱基组成，计算群体间的Kimura双参数模型（Kimura 2 parameter，K2P）遗传距离，基于邻接法（neighborjoinning，NJ）构建单倍型进化树。采用 Network 4.6.1.0软件［20］构 建 单 倍 型的 简 约 中 介（reduced-median，MJ）网络图。

使用 Arlequin3.1软件［121］计算两两群体间的遗传分化指数（Fst），并采用AMOVA来分析群体内及群体间的遗传结构和分子方差，并通过1 000次重抽样来检验Fst值的显著性。采用Tajima’sD检验［22］和 Fu’sFs检验［23］和核苷酸不配对分布（mismatch distribution）分析来检验太湖新银鱼群体的历史动态，以确定是否存在瓶颈效应或群体扩张。

2 结果与分析

2.1 COⅠ基因序列变异和群体遗传多样性

本研究共得到153条太湖新银鱼的COⅠ基因序列片段，长度为630 bp。153条COⅠ基因序列共检测到7个变异位点，其中单一信息位点有4个，简约信息位点3个，没有插入或缺失位点。全部序列中碱基A、C、T、G的平均含量分别为19.6%、34.3%、25.3%和 20.8%，其中碱基 A的含量最低，碱基C的含量最高，表现出很强的碱基组成偏向性。

整体来看，太湖新银鱼群体的单倍型多样性为 0.580±0.022，核苷酸多样性为 0.001 06±0.000 07（表1）。4个群体中，洪泽湖群体的遗传多样性最低，其单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.050±0.047和0.000 08±0.000 07；骆马湖群体的遗传多样性最高，其单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.361±0.103和0.000 62±0.000 20，但均表现为较低的单倍型多样性和核苷酸多样性特点。

2.2 单倍型分布及遗传关系

4个群体共定义了 9个单倍型（Hap1～Hap9）（表2），其中太湖和洪泽湖群体各拥有2个单倍型，高邮湖群体拥有3个单倍型，骆马湖群体拥有6个单倍型。9个单倍型中有3个是共享单倍型，其中Hap1被太湖、洪泽湖和骆马湖群体共享，Hap3和Hap4被高邮湖和骆马湖群体共享；6个是群体特有单倍型，其中Hap2是洪泽湖群体特有单倍型，Hap5是太湖群体特有单倍型，Hap6是高邮湖群体特有单倍型，Hap7、Hap8和Hap9是骆马湖群体特有单倍型。

表1 太湖新银鱼遗传多样性参数Tab.1 Genetic diversity parameters of four N.taihuensis populations

表2 COⅠ基因单倍型在太湖新银鱼各群体中的分布及数量Tab.2 Distribution and number ofm tDNA COⅠhaplotypes in each population of N.taihuensis

利用Mega 7.0软件计算9个单倍型之间的Kimura双参数遗传距离为0.001 6～0.004 8。采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建单倍型分子分子系统发育树（图2）。从图2可以看出，NJ进化树由3个谱系分支构成：单倍型Hap3、Hap6、Hap7、Hap8和 Hap9组成一支（谱系 I），单倍型Hap4和Hap5组成一支（谱系II），单倍型 Hap1和Hap2组成一支（谱系III），但分支支持率较低。4个群体的单倍型相互混杂分布，没有表现出明显的地理聚群。

2.3 群体遗传结构

利用Mega7.0软件计算4个太湖新银鱼群体间的遗传距离（表3），结果显示，4个群体间的遗传距离均较小，其中太湖群体和洪泽湖群体之间的遗传距离最小，为0.000 12；太湖群体和高邮湖群体之间的遗传距离最大，为0.001 86。

AMOVA分子变异方差分析结果显示（表4），群体间分子变异占76.84%，群体内分子变异占23.16%，分子变异主要发生在群体间。总的遗传分化系数Fst＝0.768 43，且统计检验具有极显著性（P＝0.000 0），说明群体间出现了极显著的遗传分化。进一步比较两两群体间的遗传分化系数（表3），结果显示，太湖和洪泽湖群体之间及高邮湖与骆马湖群体之间的Fst统计检验均不显著（P＞0.05），而太湖和洪泽湖群体与高邮湖和骆马湖群体之间的Fst统计检验均极显著（P＜0.001）。

图2 基于COⅠ基因构建的太湖新银鱼单倍型邻接树Fig.2 Neighbor-joining tree of 9 haplotypes from four N.taihuensis populations based on COⅠgene

表3 太湖新银鱼群体间遗传距离（对角线下）和遗传分化系数（对角线上）Tab.3 Genetic distances（below diagonal）and fixation index（above diagonal）among populations of N.taihuensis

表4 太湖新银鱼群体分子方差分析结果Tab.4 Results ofmolecular variances analysis（AMOVA）of N.taihuensis populations

采用 Network 4.6.1.0软件构建单倍型之间最小网络进化关系图（图3），结果显示，太湖和洪泽湖群体的单倍型遗传关系较近，组成一个进化单元；高邮湖和骆马湖群体的单倍型遗传关系较近，组成一个进化单元。单倍型最小网络进化关系图进一步支持了分子变异方差分析结果。

2.4 群体历史动态

对4个太湖新银鱼群体进行中性检验（表5）和歧点分布图分析（图4），结果显示，中性检测Fu’sFs及Tajima’sD的值均为负值，且洪泽湖和骆马湖群体的检验统计结果具有显著性（P＜0.05）；另外，4个群体的歧点分布图呈单峰形，表明4个太湖新银鱼群体进化过程偏离中性，经历了种群扩张。

图3 太湖新银鱼单倍型最小网络进化关系图Fig.3 Them inimum spanning network for N.taihuensis hap lotypes

图4 太湖新银鱼歧点分布图Fig.4 M ismatch distribution of four N.taihuensis populations

表5 基于COⅠ基因的太湖新银鱼种群中性检验Tab.5 Neutrality tests of N.taihuensis populations based on COⅠgene

3 讨论

3.1 太湖新银鱼种群的遗传多样性

物种遗传多样性水平的高低与其适应能力、生存能力和进化潜力存在密切的相关性，遗传多样性的降低必将给物种种质资源保护和利用带来不利影响［24］。通常认为单倍型多样性指数（h）和核苷酸多样性指数（π）是衡量一个物种群体多样性水平的两个重要指标，与种群大小、年龄结构、近缘物种基因渐渗、群体的突变和选择有着密切的关系［25］。本研究结果显示，基于COⅠ序列的4个太湖新银鱼群体的单倍型多样性为0.050±0.047～0.361±0.103，核 苷 酸 多 样 性 为0.000 08±0.000 07～0.000 62±0.000 20（表1）。GRANT和 BOWEN［26］提出单倍型多样性和核苷酸多样性大小的标准，其中单倍型多样性以0.5为临界值，核苷酸多样性以0.005为临界值，两个值越大，物种的遗传多样性就越高。比较发现，江苏省4个太湖新银鱼群体的单倍型多样性均小于0.5，核苷酸多样性均小于0.005，表明太湖新银鱼群体的遗传多样性处于较低水平。近几十年来，由于过度捕捞、环境污染、栖息地破坏等不利因素的影响，太湖新银鱼天然资源急剧衰减，种群数量明显减少，个体组成向小型化、低龄化发展［2，9］，导致了太湖新银鱼种群遗传多样性丧失。本实验室对江苏省五大淡水湖泊渔业资源开展了近十年的连续监测，结果也显示太湖新银鱼资源量不断减少，目前已处于极度匮乏状态①实验室内部资料，未公开发表数据。。另有文献报道了基于COⅠ基因的长江中下游太湖新银鱼不同地理群体的遗传多样性水平，结果表明，除巢湖 （h：0.667±0.113，π：0.001 60±0.001 91）群体外，洞庭湖（h：0.125±0.106，π：0.000 40±0.000 96）、梁子湖（h：0，π：0）、鄱阳湖（h：0.468±0.101，π：0.000 81±0.001 22）、泊湖（h：0.233±0.126，π：0.000 37±0.000 48）及南漪湖 （h：0.458±0.095，π：0.000 73±0.000 48）群体的遗传多样性均呈现出较低水平，本研究结果与之相似［11］。同时，与基于COⅠ基因的太湖大银鱼 （Protosalanx chinensis）（h：0.577，π：0.001 05）和 洪 泽 湖 大 银 鱼 （P.hyalocronius）（h：0.660，π：0.001 54）［14］及基于Cytb基因的乔什新银鱼（N.jordani）（h：0.590±0.047，π：0.000 88±0.000 11）［12］遗传多样性相比，太湖新银鱼的遗传多样性较低。由此可以推测，我国太湖新银鱼遗传多样性较低是一个普遍现象，应引起足够重视。

3.2 太湖新银鱼种群的历史动态

一般来说，物种的遗传多样性模式与其进化历史密切相关。当h大于或等于0.5、π小于0.005时，是受瓶颈效应后种群数量的迅速扩张导致；当h大于等于0.5、π大于或等于0.005时，表示种群稳定，具有比较悠久的进化历史；当h小于0.5、π大于或等于0.005时，种群经历了轻微的瓶颈效应，几乎没有影响到核苷酸变异；当h小于0.5、π小于0.005时，表明种群近期经历了瓶颈效应［26］。本研究中的4个湖泊群体单倍型多样性均小于0.5，核苷酸多样性均小于0.005，表明太湖新银鱼最近可能经历了严重的瓶颈效应。

种群历史演化通常通过两种方法来检测：其一是碱基不配对分析，该方法是基于无限位点模式（infinite-sitemodel）对样本中两两序列进行差异分析，个体间碱基不配对分布曲线呈明显的单峰形被认为种群历史有扩张现象；其二是通过Tajima’sD和Fu’sFs中性检验，D和Fs呈负值和差异显著的P值被认为种群在历史上有扩张迹象。中性检验结果显示，4个湖泊种群的D和Fs均为负值，但只有洪泽湖和骆马湖种群的中性检测统计检验有显著性差异（表5）。另外，碱基不配对分布曲线呈单峰形，均说明太湖新银鱼在历史上可能发生过种群扩张。

3.3 太湖新银鱼种群遗传结构

种群遗传结构的研究不仅可以用于评价物种群体间的变异水平和不同地理群体之间的关系，还可以确定群体中的进化显著单元和管理单元，以及制定资源的保护和管理策略［27］。遗传分化系数Fst是群体间遗传分化的重要参数之一，其值大小能反映群体间分化程度，Fst值为0～0.05时无分化，0.05～0.15为中度分化，0.15～0.25为高度分化［28］。本研究分子方差分析结果显示，群体间遗传分化系数Fst＝0.768 43（P＝0.000 0），表明在整个遗传变异中群体间占76.84%，其余的遗传变异来自于群体内，群体间具有程度较高的遗传分化。进一步比较两两群体间的遗传分化系数，结果表明，太湖和洪泽湖群体间及高邮湖和骆马湖群体间遗传分化较小，遗传分化不显著；太湖和洪泽湖群体与高邮湖和骆马湖群体间遗传分化较大，遗传分化显著。单倍型最小网络进化图也显示太湖和洪泽湖群体聚为一个进化单元，高邮湖和骆马湖群体聚为一个进化单元。

一般来说，鱼类的遗传分化格局往往与其分布的水系格局和地理距离密切相关［29-30］。从水系分布来看，太湖属于长江水系，高邮湖、洪泽湖和骆马湖则属于淮河水系；从地理位置来看，太湖、高邮湖、洪泽湖和骆马湖从南向北依次分布。由此可以得出，4个湖泊群体的遗传结构关系与水系分布及地理距离不相符合。同样，基于线粒体Cytb基因序列的太湖新银鱼和乔什新银鱼遗传分布格局也得到类似结果，并且发现银鱼的遗传格局与进化历史有密切关系［9，12］。同样，本研究中4个太湖新银鱼群体遗传格局可能更多受进化历史的影响。研究表明，银鱼起源于第三纪中期，进化过程中经历了第四纪冰期和间冰期气候的交替变化，导致银鱼栖息地数度隔离和连接，从而对银鱼的进化分化过程造成了重大影响［31］。基于Cytb基因的长江流域和淮河流域太湖新银鱼种群扩张分别发生在2.21万年前和1.90万年前［12］，均早于发生在约1.8万年前第四纪冰期最后一次大冰期［32］。因此可以推测，最后一次大冰期对太湖新银鱼种群产生很大影响，冰期期间太湖新银鱼生活在某个避难所内，随着最后一次冰期结束，气候变暖，海平面上升，太湖新银鱼种群向外扩散。在随后的进化过程中逐渐产生不同的周单倍型，形成现今的遗传结构模式。

3.4 太湖新银鱼种质资源保护

太湖新银鱼是我国特有的银鱼种类，具有较高的经济价值和营养价值，曾是我国重要的渔业捕捞对象和出口创汇水产品。太湖新银鱼属于典型的r-策略生物，生命周期只有1年，对环境变化比较敏感，种群易于波动。近年来，受过度捕捞、环境污染、栖息地破坏等多种不利因素的影响，太湖新银鱼资源已趋于枯竭，可持续发展受到严重威胁，因此，必须加强对太湖新银鱼资源的保护和管理。本研究基于COⅠ基因序列，调查了江苏省4个湖泊太湖新银鱼群体的遗传多样性水平，分析了它们的遗传结构关系，为制定相关的保护和管理措施提供了依据。根据研究结果，建议将太湖和洪泽湖种群及高邮湖和骆马湖种群分别作为一个整体进行管理和保护；将提高太湖新银鱼遗传多样性作为重点。为了恢复太湖新银鱼资源，可以采取以下措施：1）控制水环境污染，保护栖息环境，为太湖新银鱼生活和繁殖提供良好的生态环境；2）严格控制捕捞强度，严禁使用带有毁灭性破坏的电鱼、炸鱼等捕捞方法，禁止产卵期捕鱼；3）加强太湖新银鱼人工繁殖技术研究，大力开展人工增殖放流，减少捕捞量；4）加强渔业资源和生态环境监测，掌握太湖新银鱼种群动态变化。

致谢：江苏省太湖渔业管理委员会办公室、江苏省高宝-邵伯湖渔业管理委员会办公室、江苏省洪泽湖渔业管理委员会办公室及江苏省骆马湖渔业管理委员会办公室在采样过程中给予很大的帮助，一并表示感谢！