基于线粒体COⅠ基因序列的东南太平洋茎柔鱼群体遗传结构分析

刁 乐，宋 炜，蒋科技，黄洪亮，马春艳，张凤英，陈雪忠，马凌波

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

茎 柔 鱼 （Dosidicus gigas），属 枪 形 目（Teuthoidea），柔鱼科（Ommastrephidae），茎柔鱼属，是大洋性浅海种，广泛分布于东南太平洋海域。在纬度方向上，分布范围从美国加利福尼亚（37°N）到南美洲智利（47°S）的海域，在经度方向上，在赤道附近可向西延伸至125°W海域［1-3］，也有学者认为其在赤道分布范围可扩展到140°W（图1）［4］。茎柔鱼是头足类中资源量最丰富的种类之一［5］，目前商业性开发的渔场有加利福尼亚南部沿岸及外海渔场、墨西哥沿岸及外海渔场、哥斯达黎加沿岸及外海渔场、秘鲁西海岸及外海渔场和智利外海渔场等。2004—2008年间，茎柔鱼年产量稳定在70～90万t之间［6］。其中，秘鲁外海年产量最高达20万t［7］。

目前关于茎柔鱼的研究主要集中在资源丰度及 分 布［8-13］、摄 食 习 性［14-15］、生 物 学 特性［16-17］及渔场分布［18-20］等方面。在种群结构研究中主要集中在依据胴长进行划分［21-22］，也有根据繁殖季节、耳石、内壳、角质颚结构进行划分［23-25］， 例 如， NIGMATULLIN 等［3］、ARGUELLES等［26］和 YATSU等［27］分别根据成年雄性与雌性个体的胴长、性成熟胴长大小和产卵季节等对茎柔鱼种群进行划分。

随着分子生物学技术的快速发展，运用线粒体Cytb、COI序列，微卫星标记等方法对茎柔鱼的群体遗传结构研究也逐渐增多［28-33］。mtDNA具有结构简单、母系遗传、进化速率快、重组率低等特点，作为一种重要的分子遗传标记而被广泛应用于水产生物的系统发育、生物地理学和保护生物学研究［34］。其中，细胞色素氧化还原酶Ⅰ（COⅠ）基因进化速率适中，适合种群水平差异的检测［35-36］，已广泛应用于头足类群体遗传变异和系统发育研究中［28］。

茎柔鱼生命周期短，大约为1年，且终生只产1次卵，其资源量很容易受到海洋环境的变化而发生波动［27，37］。本研究通过线粒体 DNACOⅠ序列的多态性对秘鲁外海东南太平洋茎柔鱼群体进行了遗传结构分析，以期为其合理开发与利用提供理论依据。

图1 茎柔鱼分布Fig.1 Distribution of Dosidicus gigas

图2 茎柔鱼采样地点示意图Fig.2 Sampling sites of Dosidicus gigas

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用茎柔鱼于2014年6—7月采集于秘鲁外海（图2）。具体采集的地点、时间和样品数见表1。样品采集后取套膜肌肉组织，置于95%乙醇中，-20℃保存备用。

1.2 基因组DNA的提取

采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（北京，天根生化科技有限公司）提取总DNA，提取的DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量后，保存于-20℃备用。

表1 茎柔鱼的采集样品数Tab.1 Sample number of Dosidicus gigas in each location

1.3 茎柔鱼mtDNA COⅠ序列的扩增与测序

使用兼并引物Dg-COI-F（TCCACAAAYCAY AAAGATATTGAAC）和Dg-COI-R（ACYTCTGGGT GMCCAAARAATCA）扩增茎柔鱼mtDNACOⅠ部分序列，PCR总体系为25μL：10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.5μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）2μL，rTaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.5μL，上下游引物（10μmol·L-1）各 0.75μL，模板 DNA 1μL，加双蒸水至总体积25μL。PCR反应程序为：94℃预变性 5min；94℃变性 30 s，50℃退火 45 s，72℃延伸50 s，35个循环；最后72℃充分延伸7 min；10℃保存。扩增产物使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后送上海杰李生物技术有限公司正向测序。

1.4 数据分析

利用MEGA 5.1中的Clustal W程序对序列进行排序校正，按照TrN进化模型来构建单倍型邻近关系树，系统树的可靠性采用1 000次重复抽样评估。同时计算群体内及两两群体间的遗传距离，根据Kimura-2-parameter（K-2-P）模型构建茎柔鱼群体间的UPGMA树。采用遗传分化指数（Fst）来评价两两群体间的遗传差异，通过1 000次重复抽样来检验两两群体间Fst的显著性，使用Nm＝（1Fst）／（4Fst）计算两两群体间的基因交流。

利用DnaSP 5.1软件确定单倍型数目及分布、核苷酸多样性。使用Arlequin 3.1软件的分子方差分析（AMOVA）来评估群体间遗传变异，通过1 000次重复抽样来检验不同遗传结构水平上的协方差的显著性。采用Fu’sFs和Tajima’sD中性检验和核苷酸不配对分布来检验群体历史动态，以此指示种群历史的稳定性或种群增长情况。

2 结果与分析

2.1 序列变异特征分析

经测序和校对，获得626 bp线粒体COⅠ基因片段。所得序列共包含42个变异位点，其中单一信息位点34个，占80.95%；多态简约位点8个，占19.05%。存在33个转换位点和8个颠换位点，另外1个位点同时存在转换和颠换现象，没有检测到插入和缺失现象。A、T、G和C平均含量分别为 26.5%、35.3%、15.8%和 22.4%，A+T含量（61.8%）明显高于 G+C含量（38.2%）。

2.2 单倍型在群体中的分布及遗传关系

在所检测的茎柔鱼239个样本中共出现46种单倍型（MK336912～MK336957），但单倍型间的序列分歧值很低，与单倍型Hap1相比，其余45种单倍型中有33种与其只存在1个核苷酸的差异，详见图3。群体间共享的单倍型为12个，占比26.0%，其余34个单倍型为某个群体所特有，各群体单倍型分布见图4。Hap44为所有群体共享，其拥有频率也最高，共150个个体拥有，占比62.7%。Hap43和Hap45为7个群体所共享，分别有15、14个个体拥有此单倍型。Hap30为4个群体共享，Hap13和Hap27分别有3个群体共享，Hap8、Hap15、Hap20、Hap22、Hap38和 Hap46均为2个群体共享。在特有的单倍型中，Dg2、Dg3、Dg4、Dg5、Dg7、Dg8、Dg11、Dg12所特有的单倍型个数分别为 7、3、4、3、4、2、4、10个。

2.3 群体遗传多样性和遗传结构分析

东南太平洋茎柔鱼8个群体的遗传多样性参数见表2。基于COⅠ基因所有序列得到的8个群体总的单倍型数、单倍型多样性指数、多态位点数和核苷酸多样性指数分别为46、0.599±0.038、42和0.001 38±0.001 71。从单倍型参数来看，Dg12群体的单倍型数和单倍型多样性指数均最高，分别为 16和 0.759±0.086；Dg7群体的单倍型多样性指数最低，为0.469±0.114。从核苷酸多样性参数来看，Dg11群体的核苷酸多样性指数最高，为0.003 63±0.001 21；Dg5群体的核苷酸多样性指数最低，为 0.001 04±0.001 07。总体来看，各群体间遗传多样性无明显差异，均具有较高的单倍型多样性指数与较低的核苷酸多样性指数，这与闫杰等［37］、刘连为等［30，32-33］得到的结果一致。

分析秘鲁外海8个茎柔鱼群体间的遗传距离，群体间的平均遗传距离在0.001 04～0.002 01之间。其中，Dg2与Dg12之间的遗传距离最大（0.002 01），Dg5与 Dg7之间的遗传距离最小（0.001 04）（表3）。从 UPGMA树来看（图5），秘鲁外海茎柔鱼群体间没有明显的分化关系，Dg5与Dg7先聚在一起然后依次与其他群体聚在一起，最后与Dg2聚在一起。

图3 茎柔鱼线粒体COⅠ基因序列变异位点Fig.3 Variable sites ofm itochondrial COⅠgene of Dosidicus gigas

表2 不同茎柔鱼群体的遗传多样性参数Tab.2 Parameters of genetic diversity of different populations of Dosidicus gigas

图4 茎柔鱼46个单倍型在8个群体中的分布及其分子系统树Fig.4 Distribution of 46 haplotypes among 8 Dosidicus gigas populations and its NJmolecular phylogenetic tree

图5 基于K im ura遗传距离的秘鲁外海茎柔鱼8个群体之间的UPGMA树Fig.5 UPGMA tree of Dosidicus gigas populations built under K-2-P genetic distance

两两群体间的遗传分化系数Fst值为-0.019 12～0.027 94之间（表 3），统计检验均不显著（P＞0.05），说明秘鲁外海茎柔鱼群体间存在高度的遗传同质性，不存在显著差异的遗传结构分化。基于Fst值计算群体间基因流Nm，各群体间的Nm均大于1，说明各群体间具有较高的基因交流水平（表4）。

AMOVA分析结果显示，群体内变异和群体间的变异百分比分别为99.74%和0.26%，表明群体间不存在显著的遗传结构（表5）。

表3 茎柔鱼群体间遗传距离（对角线下）和遗传分化系数（F st）（对角线上）Tab.3 Pairw ise genetic distances（below diagonal），fixation index（F st）（above diagonal）between every two populations of Dosidicus gigas

表4 茎柔鱼两两群体间的基因流（对角线下）Tab.4 Gene flow value（below diagonal）between every two populations of Dosidicus gigas

表5 茎柔鱼群体遗传差异的AMOVA分析Tab.5 Analysis ofmolecular variance（AMOVA）among populations of Dosidicus gigas

2.4 群体历史动态分析

对Tajima’sD和 Fu’sFs值进行中性检验（表2）。Tajima’sD值均呈负值，且呈显著差异，Fu’sFs值同样均呈负值，经检验呈极显著差异，研究表明茎柔鱼群体在东太平洋范围内曾经经历过种群扩张事件。

3 讨论

3.1 外部形态特征与COⅠ基因判别东南太平洋茎柔鱼种群的解释

头足类属于常年产卵、生长迅速且生命周期短的物种。陈新军等［38］认为，长度频度分析方法不适合用来研究头足类的年龄和生长。此外，胡贯宇等［39］研究表明头足类还具有洄游习性，导致不同世代的群体混合在一起，因而在进行日龄和生长的分析时无法排除不同世代、不同群体之间的干扰［40］。NIGMATULLIN等［3］还发现茎柔鱼小个体群体主要分布在赤道附近，大个体群体主要分布在高纬度海域，这可能是因为在温度较高的环境下，茎柔鱼性成熟加快，个体较小［41］；相反，在温度较低的环境下，茎柔鱼性成熟缓慢，个体较大［39］。因此，影响茎柔鱼胴长的因素有很多，其中包含地理环境或物理因素，即利用胴长等外部形态特征可能很难判别东南太平洋茎柔鱼种群属性。

线粒体DNA（mtDNA）中，细胞色素氧化还原酶Ⅰ（COⅠ）基因已被证明适合头足类群体遗传变异和系统发育的研究且已广泛应用［28］。刘连为等［32］针对 NIGMATULLIN等［3］划分的大型群与中型群茎柔鱼，利用mtDNA与SSR 2个分子标记对其进行分析，研究表明，大型群与中型群茎柔鱼可能在产卵洄游过程中发生基因交流，建议将秘鲁外海大型群与中型群茎柔鱼看作1个管理单元。闫杰等［38］利用mtDNA对东太平洋公海茎柔鱼种群遗传结构进行了初步研究，认为可以大致将东太平洋公海茎柔鱼以赤道为界分为南方和北方2个地理群，即将东南太平洋茎柔鱼视为一个种群，本研究结果与其一致。

3.2 茎柔鱼群体遗传多样性分析

遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和，也是物种适应复杂多变的环境、维持生存和进化的重要基础。一个物种的遗传变异越大，其进化潜力就越大，对环境变化的适应能力也就越强［42］。本研究运用 mtDNACOⅠ序列对东南太平洋茎柔鱼8个群体的遗传多样性进行了分析。结果表明，Dg12群体的单倍型数和单倍型多样性均最高，Dg12群体在这8个群体中最靠近赤道海域，在赤道海域海流等作用下，可能与赤道海域的茎柔鱼有基因交流，而这也是其单倍型多样性最高的原因之一，这与刘连为等［33］研究结果一致。

本研究239个样本中共获得46个单倍型，Hap44为所有群体共享，其为150个个体拥有，推测Hap44很可能是较原始的单倍型类型［43］。种群共享及个体共有单倍型出现的次数多，说明秘鲁外海茎柔鱼间基因交流频繁。8个群体间均表现为高单倍型多样性（h＞0.5）、低核苷酸多样性（π＜0.005）的模式，说明种群经历了显著的群体扩张，这与闫杰等［37］和刘连为等［33］的研究结果一致。根据GRANT等［44］划分的4种单倍型多样性和核苷酸多样性关系模式，本研究茎柔鱼群体属于第二种模式，即高单倍型多样性和低核苷酸多样性。庞大的种群数量是维持自然种群内具有较高单倍型多样性的主要基础之一。通常一个小的有效种群经过近期快速增长成为一个大群体时，该种群单倍型多样性会非常丰富，但没有足够时间使核苷酸产生变异，这就造成了“高h、低π”的遗传多样性模式［43］。茎柔鱼是短生命周期种类，性成熟周期短，繁殖季节较长，这样的生活史特征对群体快速增长、产生高h具有一定的促进作用。

3.3 茎柔鱼群体遗传结构分析

本研究单倍型邻近关系树及群体间的UPGMA进化树均表明，东南太平洋茎柔鱼群体间不具有显著的系统地理格局。两两群体间的Fst值以及AMOVA分析结果也同样表明，群体间的遗传差距不明显，不存在显著差异的群体遗传结构。闫杰等［37］、刘连为等［33］对东太平洋茎柔鱼群体间遗传结构的分析，均显示各群体间不存在显著的遗传结构，本文的结果与其一致。而对秘鲁外海大小型茎柔鱼群体和北太平洋茎柔鱼不同产卵群体间结构的分析结果显示，秘鲁外海大小型群体、北太平洋不同产卵群体间也均不存在显著的遗传结构［32］。

在缺少扩散障碍的海洋环境中，海洋生物的卵、幼体、成体因具有较强的扩散能力从而使群体间产生频繁的基因交流，这将导致海洋生物在非常广阔的分布范围内具有遗传同质性［43］。东南太平洋海域位置开阔，无地理阻碍，东太平洋在赤道南部存在洋流的闭合环路，海水从高纬度流向赤道，在秘鲁海域形成上升流系统和秘鲁离岸流。茎柔鱼具有较强的游泳能力及长距离的季节洄游习性，使东南太平洋海域茎柔鱼群体间不存在基因交流障碍，导致茎柔鱼群体间的遗传差距并不明显。简言之，秘鲁外海域缺乏地理障碍，秘鲁洋流、离岸流的作用、季节洄游习性以及其较强的运动能力，促使该海域茎柔鱼群体间没有显著的遗传结构。

综上所述，本研究中东南太平洋取样点的茎柔鱼群体间不存在显著的群体遗传分化。为了更加准确地确定茎柔鱼群体间的遗传结构，在后续的研究中应该扩大取样范围，同时补充不同季节、大小型群体的样本，采用不同的分子标记，进行系统分析，为茎柔鱼渔业资源的管理提供丰富的数据支持。