牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌三重 PCR快速检测方法的建立

杨 莉, 余 波, 张 涛, 姜玲玲,刘 镜, 杨丽娟, 孙启跃, 徐景峨,龙 玲, 唐远江, 余国富, 邹茂华, 吴位珩*

(1.贵州省农业科学院 畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005； 2.贵州省清镇市动物疫病疫防控制中心，贵州 清镇 551400； 3.贵州省黔西县农业农村局，贵州 黔西 551500)

牛呼吸道疾病病原复杂，主要由牛支原体、牛结核分枝杆菌和牛巴氏杆菌等病原菌引起。牛支原体病常常继发或混合感染牛巴氏杆菌，从而加重病情，感染牛呼吸急促、流涎、发烧、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛出血，严重的造成死亡[1]。牛结核分枝杆菌主要是呼吸道传播的慢性消耗性疾病，病牛在初期食欲正常，主要呈现顽固性的咳嗽，后期肺部病变严重时，表现呼吸困难，咳嗽加重，流脓性鼻汁，胸部听诊有干性或湿性特征，有时可听到摩擦音，病畜日渐消瘦、贫血等[2]。在临床和病理解剖情况下，3种疾病难以区分，容易混淆。目前常用的实验室诊断方法有细菌学检测、病原菌分离培养、生化试验、动物回归试验、免疫学诊断等，但这些方法所需时间长、操作繁琐、准确性低，很难适应临床快速诊断的需要。因此，根据PCR原理，分别针对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列设计了特异性引物，建立快速、准确检测这3种疾病的PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 牛支原体菌株由华中农业大学动物医学院惠赠，多杀性巴氏杆菌(cvcc1663)、牛分枝杆菌参考菌株[编号为93006(4)]、魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌均购自中国兽医微生物菌种保藏中心，猪源支原体、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金色葡萄球菌DNA模板均由贵州省农业科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室提供。

1.1.2 生化试剂及主要仪器

试剂：Lab-Aid 820核酸提取Mini试剂盒(试剂条、磁棒套、缓冲液ATL、洗脱液等)和DTT试剂均购于厦门致善生物科技股份有限公司，Goldview核酸染料、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、EDTA、Tris-HcL、琼脂糖、DL2000 Marker、Premix Taq Version 2.0(E×Taq Version 2.0 plus dye)及去离子水购于天根生化科技(北京)有限公司,PPLO肉汤培养基和PPLO固体培养基购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司,改良罗氏培养基购自杭州创新生物检控技术有限公司，特级马血清、酵母粉和精氨酸胰蛋白胨购自北京索莱宝科技有限公司。

仪器：核酸提取仪(Lab-Aid 820，厦门百维信生物科技有限公司)，电子天平(AR2140，美国奥豪斯)，高速离心机(D3024，北京大龙)，pH测量仪(Delta 320A/c，梅特勒-托利多)，梯度PCR扩增仪(BIOMETRA，德国)，电泳仪(DDY-10C，北京六一生物科技有限公司)，紫外透射仪、凝胶成像仪(BIO-RAD Gel Doc XR，美国伯乐)，超纯水器(ATZ-10-T，台湾艾科蒲)，紫外可见光度计(Implen NanoPhotomet，德国)，移液器(芬兰)，移液头、PCR离心管(美国)。

1.2 引物的设计与合成

分别对牛支原体oppD基因序列(扩增片段为226 bp，Genbank上的登录号为AF130119.1)、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列(扩增片段为638 bp，登录号为AF016259.1)、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列(扩增片段为478 bp，登录号为X57835.2)应用Primer Primer5.0基因分析软件设计特异性引物，引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成，具体引物如下：

牛支原体上引物：5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′，下引物：5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′；牛多杀性巴氏杆菌上引物：5′-GCTGACATTACTGCTCTATCCGCTAT-3′，下引物：5′-GACGGCTAACATCATCATCCAA-3′；牛结核分枝杆菌上引物：5′-GATGGCGAACTCAAGGAGCACA-3′，下引物：5′-ACTGAGATCCCCTATCCGTATGGT-3′。

1.3 模板处理及基因组提取

1.3.1 参考菌株DNA的提取 牛支原体采用PPLO培养基培养，牛多杀性巴氏杆菌采用LB培养基培养，牛结核分枝杆菌采用改良罗氏培养基进行培养，魏氏梭菌和禽源多杀性巴氏杆菌采用LB培养基培养。取培养菌液1 500 μL于1.5 mL的离心管中，10 000 r/min离心2 min，弃上清液，收集沉淀。将试剂条的左边第1孔溶液取出加入到收集的沉淀中，用移液管反复吹打使沉淀物充分悬浮，处理完毕后，将之取出在试剂条的左边第1孔中，同时加入30 μL配制好的DTT溶液，混匀。将试管条架放入核酸提取仪中,试管条架推到位，按核酸提取Mini试剂盒使用说明书中核酸提取仪操作步骤进行。

1.3.2 临床组织样本DNA的提取 取样本组织少许，用灭菌手术剪剪碎，加入900 μL生理盐水，反复冻融3次，然后5 000 r/min离心5 min，取700～900 μL上清液，加入蛋白酶K 20 μL，10%SDS液100 μL，55℃水浴箱中加热30 min至组织消化完全，取出冷却。将核酸提取Mini试剂条在桌面轻轻磕碰，使各试剂落入管底，然后将试剂条放在试管条架上，撕去封管膜，在试剂条左边第1孔中加入完全消化的组织液200 μL和30 μLDTT溶液，混匀。将试管条架放入核酸提取仪中,试管条架推到位，按核酸提取Mini试剂盒使用说明书中核酸提取仪操作步骤进行。

1.3.3 牛全血样本DNA的提取 取待检样本全血1 mL于1.5 mL离心管中，10 000 r/min离心2～5 min，弃上清液，沉淀采用生理盐水清洗2次，弃上清液。加入TE缓冲溶液200 μL，蛋白酶K 40 μL，裂解液160 μL，充分混匀，置60℃水浴15～20 min，加入无水乙醇200 μL，充分摇匀，简短离心去除管盖内壁的水珠。将上述溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)12 000 r/min离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500 μL 70%乙醇，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，用同样方法，采用70%乙醇，再清洗1次，去废液。将吸附柱放入收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒掉废液，将吸附柱放置室温中5～10 min，晾干。将晾干的吸附柱放入干净的收集管中，加入TE缓冲溶液60～100 μL，室温放置5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到冷藏管中，即为提取的DNA模板，于-20℃保存备用。

1.4 PCR体系的建立

1.4.1 单一PCR体系的建立 25 μL初始反应体系：Premix Taq (E×Taq Version 2.0 plus dye)为12.5 μL，牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌DNA模板为2 μL，分别加入对应的特异性引物各1 μL，加入dd H2O至25 μL，同时设阴性对照组。初始扩增程序：94℃ 5 min预变性；94℃ 40 s，58℃ 40 s,72℃60 s，循环30次；72℃ 7 min延伸。在选择最佳的退火温度时,设置梯度PCR，并对引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA用量等重要参数进行优化试验，反应结束后将扩增产物取5～7 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2 三重PCR体系的建立 100 μL初始反应体系： Premix Taq (E×Taq Version 2.0 plus dye)为50 μL，牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌DNA模板各4 μL，3对上、下引物各2 μL，加入ddH2O至100 μL，同时设阴性对照组。根据单一PCR体系，设置初始扩增程序：94℃ 10 min预变性；94℃ 1 min，60℃ 50 s,72℃ 1 min，循环30次；72℃ 10 min延伸。同时在选择最佳的退火温度时设置梯度PCR，并对引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA用量等重要参数进行优化试验，反应结束后将扩增产物取5～7 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR特异性试验

1.5.1 单一PCR特异性 分别用牛支原体菌株、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌、魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金色葡萄球菌DNA为模板，加入相应的单一PCR引物，按照单一PCR反应体系进行扩增和凝胶电泳检测，同时设空白对照。

1.5.2 三重PCR特异性 在单一PCR试验的基础上，进行三重PCR特异性试验。依次以牛支原体菌株、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌、魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金色葡萄球菌DNA为模板，分别加入单种引物各1 μL，或者3种引物等体积混合物6μL，单一PCR DNA模板量为2 μL，加入ddH2O至25 μL，同时设阴性对照组。三重PCR DNA模板量各为4 μL，加入ddH2O至100 μL，同时设阴性对照组。

1.6 三重 PCR敏感性试验

采用Nanophotometer微量核酸分析仪对提取的牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的DNA模板进行核酸含量测定。在进行敏感性试验时，按10倍稀释法对DNA模板进行稀释后，各取4 μL模板混合，加入多重PCR反应体系，加ddH2O补至100 μL，进行PCR扩增试验，同时设空白对照。

1.7 三重 PCR重复性试验

将上述PCR检测重复3次验证方法的重复性。

1.8 临床样本的三重 PCR检测

对贵州省引进的能繁母牛隔离场采集的牛鼻拭子样品163份、凯里屠宰场采集的牛肺样品10份、黔西牛场采集的病死牛肺样品1份、某牛场采集的牛结核PPD阳性样本5份分别进行单一牛支原体PCR检查和三重PCR检查；将采集的牛鼻拭子进行24 h增菌后，进行PCR方法检查。

1.9 三重 PCR产物克隆测序及分析

将三重PCR扩增片段经胶回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行克隆和测序，并用BLAST程序对GenBank数据库进行序列的同源性比对。

2 结果与分析

2.1 三重 PCR反应体系的优化

从图1看出，三重PCR反应在退火温度为52.5～62℃时能得到比较清晰的PCR产物扩增条带，且各退火温度PCR产物的扩增条带间影响不大。因此，确定该三重PCR退火温度为60℃。反应体系为100 μL，该三重PCR可出现清晰的扩增条带。在Mg2+浓度为3 mM时，可得到均一、稳定、清晰的扩增条带。比较各引物浓度的扩增效果，结果确定该三重PCR反应的最适合的浓度分别是：oppD为20 μM，Pm-kmt为20 μM，IS6110为20 μM。菌株模板DNA用量为4 μL，退火温度为60℃，循环数为30次，扩增出来的PCR产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，能够形成明亮、清晰、均一的目的条带。

注：M为Marker DL2000，1为阴性对照，2～9为退火温度，分别为52℃、54℃、55℃、57℃、59℃、60℃、61℃、62℃。

Note: M, Marker DL2000; 1,negative control; 2～9,annealing temperature of 52℃, 54℃, 55℃, 57℃, 59℃, 60℃, 61℃ and 62℃.

图1 各退火温度 PCR产物的扩增条带

Fig.1 The amplification bands of PCR product at different annealing temperature

2.2 PCR的特异性

2.2.1 单一PCR的特异性 从图2看出，设计的特异性均能扩展出牛支原体、牛结核分枝杆菌、牛多杀性巴氏杆菌相应的目标条带，分别是226 bp、638 bp和478 bp，与预期大小相符合。

注：M为Marker DL2000，1为阴性对照；2分别为标准牛支原体(A)、标准牛结核分枝杆菌(B)和标准牛多杀性巴氏杆菌(C)；3分别为牛支原体分离株(A)、牛结核分离株(B)和牛巴氏杆菌分离株(C)；4为牛结核分枝杆菌；5为牛支原体；6为牛源大肠杆菌；7为魏氏梭菌；8为禽源多杀性巴氏杆菌；9为猪源支原体；10为嗜血杆菌；11为猪大肠杆菌；12为沙门氏菌；13为牛源衣原体；14为羊源衣原体；15为金色葡萄球菌。

Note: M represents Marker DL2000; 1 respresents negative control; 2 respresents the standardmycoplasmabovis(A),pasteurellamultocida(B) andmycobacteriumtuberculosis(C) ; 3 respresents the isolated strain ofmycoplasmabovis(A),pasteurellamultocida(B) andmycobacteriumtuberculosis(C); 4 respresentsmycobacteriumbovis; 5 respresentsmycoplasmabovis; 6 respresentsBovinee.coli; 7 respresentsclostridiumwelchii; 8 respresentsPasteurellamultocidafrom poultry; 9 respresentsmycoplasmafrom pig; 10 respresentshaemophilus; 11 respresents swineescherichiacoli; 12 respresentssalmonella; 13 respresents cowchlamydia; 14 respresents sheepchlamydia; 15 respresentsstaphylococcusaureus.

图2 牛支原体(A)、牛结核分枝杆菌(B)和多杀性巴氏杆菌(C)的特异性 PCR扩增产物

Fig.2 Specific PCR amplification products ofM.bovis(A),M.tuberculosis(B) andP.muttocida(C)

2.2.2 三重PCR的特异性 从图3看出，三重PCR反应体系能从混合模板和单独模板中同时扩增出牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌特异性目的条带，各引物与模板之间没有明显的互相干扰。其他的病原菌魏氏梭菌、禽源多杀性巴氏杆菌、猪源支原体、牛源大肠杆菌、嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛衣原体、羊衣原体、金色葡萄球菌均未出现目的条带，说明该三重PCR特异性良好。

注：M为Marker DL2000，1为阴性对照，2为3种病原菌混合模板，3为牛巴氏杆菌分离株，4为牛结核分枝杆菌，5为牛支原体，6为牛源大肠杆菌，7为魏氏梭菌，8为禽多杀性巴氏杆菌，9为猪源支原体，10为嗜血杆菌，11为猪源大肠杆菌，12为沙门氏菌，13为牛源衣原体，14为金色葡萄球菌。

Note: M represents Marker DL2000; 1 respresents negative control; 2 respresents mixed pathogenic bacteria; 3 respresents bovinepasteurellaisolates; 4 respresentsmycobacteriumbovis; 5 respresentsmycoplasmabovis; 6 respresents Bovine e. coli; 7 respresents clostridium welchii; 8 respresentsPasteurellamultocidafrom poultry; 9 respresentsmycoplasmafrom pig; 10 respresentshaemophilus; 11 respresents swineescherichiacoli; 12 respresentssalmonella; 13 respresents cowchlamydia; 14 respresents sheepchlamydia; 15 respresentsstaphylococcusaureus.

图3 三重 PCR特异性试验结果

Fig.3 Results of triple PCR specificity test

2.3 三重 PCR的敏感性

敏感性试验结果显示：牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的DNA模板最高稀释倍数分别是10-4倍、10-4倍和10-6倍，对应的牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的DNA模板浓度分别是5.306×10-3ng/μL、3.075×10-2ng/μL和1.605×10-4ng/μL，三重PCR较单一PCR的灵敏度降低了100倍(图4)。

注：M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：原液；3：10-1倍稀释液； 4：10-2倍稀释液；5：10-3倍稀释液；6：10-4倍稀释液； 7：10-5倍稀释液；8：10-6倍稀释液 。

Note: M represents Marker DL2000; 1 respresents negative control; 2 represents the original solution; 3 respresents 10-1diluent; 4 respresents 10-2diluent; 5 respresents 10-3diluent; 6 respresents 10-4diluent; 7 respresents 10-5diluent; 8 respresents 10-6diluent.

图4 三重 PCR敏感性试验结果

Fig.4 Results of triple PCR sensitivity test

2.4 三重 PCR的重复性

用建立的三重PCR方法重复检测牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌DNA样品，3次结果均一致，说明方法的重复性良好。

2.5 三重 PCR扩增产物序列的同源性

扩增的牛支原体oppD基因的226 bp片段、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因的638 bp片段、牛结核分枝杆菌IS6110基因478 bp片段送检测序结果分别与GenBank中已发表的牛支原体oppD基因(登录号：AF130119.1)、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因(登录号：AF016259.1)、牛结核分枝杆菌IS6110基因(登录号：X57835.2)中相应片段核苷酸序列同源性均在98%以上，表明该三重PCR扩增产物的序列是正确的。

2.6 临床样本检测

163份牛鼻拭子样品单一牛支原体PCR检查出阳性样本60份，三重牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌PCR检测阳性样本60份；牛鼻拭子进行24 h增菌后牛支原体PCR阳性检出样本65份，与未培养的样本阳性符合率为92.3%。凯里屠宰场采集的10份(头)牛肺单一PCR检测为阴性，三重PCR检测也为阴性。黔西牛场采集的1份(头)样品单一PCR多杀性巴氏杆菌检测为阳性，三重PCR检测也为阳性。某牛场采集的5份(头)牛结核PPD阳性样本中，牛结核单一PCR检测阳性样本4份(头)，三重牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌PCR检测阳性样本4份。表明，各样本单一PCR检查和三重PCR检测阳性符合率均为100%。

3 结论与讨论

试验在对单一PCR进行优化后建立了三重PCR，通过优化试验，确定该三重PCR的最佳扩增条件为：反应最适的浓度分别是oppD为20 μM，Pm-kmt为20 μM，IS6110为20 μM。菌株模板DNA用量为4 μL，退火温度为60℃，循环数为30。研究建立的三重PCR检测方法具有准确、特异、快速的特点，可同时检测牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌3种呼吸道致病菌，并在临床应用上取得了较好的效果，各样本三重PCR检测结果与单一PCR检查符合率为100%。

牛支原体oppD基因已被证实在牛支原体中高度保守且是牛支原体的特异性基因。2015年袁海文等[3]对牛支原体贵州流行株oppD/F基因进行的克隆、测序及序列分析表明，牛支原体贵州株与湖北株、重庆株及内蒙古株亲缘关系最近，与牛支原体国际标准株PG45处于同一进化分支上，但已呈现进化差异性，而与其他支原体如无乳支原体、关节炎支原体、鳄鱼支原体亲缘关系较远，与丝状支原体丝状亚种SC型标准株亲缘关系更远；ATP结合蛋白oppD/F基因和DNA聚合酶Ⅲ基因为目标基因的PCR，已证实能够较好地区别牛支原体与牛无乳支原体的感染[4]。赵自云等[5-7]研究表明，序列6110是结核分支杆菌基因组中的一个多拷贝的保守片段，该序列作为扩增靶序列，有较高的敏感性和特异性，是分子生物学方法研究结核杆菌的首选片段。多杀性巴氏杆菌是具有异质性特征的病原亚种群，常引起多种动物以败血症和呼吸系统疾患为主的疾病。Kmt基因是多杀性巴氏杆菌的种特异性片段，因此，利用Kmt基因的PCR扩增法检测多杀性巴氏杆菌现已普遍被国内外学者认可[8-10]。综上研究是试验针对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列设计了特异性引物的基础。

临床样本进行牛支原体分离培养需2～4 d，牛结核分枝杆菌分离培养需10～15 d，而牛多杀性巴氏杆菌的分离培养与上述2种病原菌一样，培养复杂、费时，要求营养高，分离培养阳性率低，很难适应目前基础生产需要。建立的三重PCR检测方法能直接出结果，单一PCR检测方法与三重PCR检测方法符合率高达100%，显著加快了临床样本的诊断速度，可为牛呼吸系统疾病的流行病学调查及诊断提供实用技术，具有推广应用价值。