2种细菌不同处理对枳壳生长及根系发育的影响

许志文，吴 楚，蒲 尧，叶缘铭

(长江大学 园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

植物内生真菌(endophytic fungus)是指在其生活史的一部分阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织、器官内部的真菌，被其感染的宿主植物不表现或者暂时不表现出明显的病害症状[1]。内生真菌普遍存在于各种陆生和水生植物中，不但种类繁多，而且分布范围较广[2]，主要分布于植物的叶鞘、种子、花、茎、叶片和根等细胞间。研究发现，宿主植物在感染内生真菌时比没有感染内生真菌更具生存竞争力，如生长速度快，抗逆境、抗病害和抵抗动物危害的能力加强等，而这些能力的增强，依赖于内生真菌寄生或者定殖在宿主植物体内的阶段所产生出来的一些次生代谢产物。研究表明，从植物中分离出的内生真菌能产生多种次生代谢产物，且产生的次生代谢产物十分丰富，具有多种生物活性[3]。近年来，由于内生真菌的次生代谢物在病虫害的生物防治[4]和医药工业[5]上的用途和范围逐渐增大，有关内生真菌的研究逐渐受到重视。

菌根辅助细菌(mycorrhiza helper bacteria, MHB)是指能够与菌根真菌特异性结合，并促进菌根真菌在宿主植物根部的定殖、生长，从而间接地促进植物生长的一类植物根际细菌[6]。菌根辅助细菌与菌根真菌双接种可显著促进菌根真菌孢子萌发、促进真菌菌丝生长，提高菌根侵染率等，从而有效地促进寄主植物生长[7]。因此，菌根真菌与菌根辅助细菌作为植物微环境中的重要组成部分，在提高植物产量、维持农林生态系统的稳定等方面都具有重要作用[8]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是世界性分布的内生真菌，常在土壤中、腐烂的木材上被发现[9]，其不但具有适应广、代谢物质多样、寄生广泛、环境友好等特点[10]，且能与植物的根系共生并有效地促进植物根系生长和发育，使其从土壤中获取更多营养，通过增加不溶性化合物的溶解性和微量营养素的可利用性[11]，从而促进植物的生长发育以及产量的提高。木霉菌与植物共生能提高植物叶片中叶绿素的含量，并且可以有效促进植物生长发育和干物质的积累[12]。陆淼等[13]研究表明，使用哈茨木霉(Trichodermaharzianum)对甜瓜进行接种，能有效地促进甜瓜幼苗生长。李进一等[14]研究发现，短密木霉(Trichodermabrevicompactum)能显著促进黄瓜幼苗侧根的生长发育。袁扬等[15]研究表明，木霉菌能促进鸭茅叶片中的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量增加。伍晓丽等[16]研究表明，深绿木霉(Trichodermaatroviride)发酵液菌丝体能显著促进青蒿幼苗生长。杨兴堂等[17]研究表明，木霉菌株(Trichodermaasperellum)能降解磷钾，同时可以产生吲哚乙酸，从而促进植物生长。另有研究发现，木霉菌产生的生长素和赤霉素是促进植物生长和刺激养分从土壤向根系转移的关键激素[18]，如施用棘孢木霉(Trichodermaasperellum)能提升香蕉苗株高和根系活力。

洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia)是一种广泛存在于土壤、水和植物根围的革兰氏阴性细菌，其不仅是一个种，而是指一组表型相近、基因型不同的细菌群，通称为洋葱伯克氏菌群(Burkholderiacepaciacomplex, Bcc)[19]。洋葱伯克细菌具有多种有益功效，其不仅可作为生物降解菌降解土壤中残留的农药、净化污水，还可以作为植物促生菌促进植物生长[19-20]。

世界上已知柑橘的栽培历史已超过4 000年[21]，其产量和年贸易额次于小麦和玉米，为世界第三大国际贸易农产品和世界第一大水果[22]。而枳壳(Poncirustrifoliata)作为柑橘的常用砧木，其生长状况的优劣对于柑橘产业的发展起着部分的决定作用。而棘孢木霉作为植物的内生真菌，在植物体内产生许多活性代谢物，从而对植物起到促进生长的作用[23]。有研究表明，洋葱伯克霍尔德细菌也能对植物起到一定的促进生长的作用[19]。目前，鲜见木霉菌和洋葱伯克霍尔德细菌处理枳壳的报道。为此，研究枳壳在木霉菌和洋葱伯克霍尔德细菌不同处理下，其光合作用的变化和生物量的积累差异以及根系的发育情况，以期为柑橘砧木枳壳的快速生长及柑橘的产业发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

枳壳种子：采自长江大学园艺园林学院园艺实习场。棘孢木霉(Trichodermaasperellum，Ta，BNCC227595)和洋葱伯克霍尔德细菌(Burkholderiacepacia，Bc，BNCC138591)，均购自北纳生物科技有限公司(http://www.bnbio.com/)。

试剂：PDA培养基、LB培养基、KMnO4溶液。

仪器：血球计数板、光学显微镜、恒温摇床、LI-6400 XT便携式光合作用系统(Li-COR, USA)、FS-3000便携脉冲调制式荧光仪、WINRHIZO根系扫描仪器、恒温鼓风干燥箱、电子天平。

1.2 方法

1.2.1 菌株孢子菌悬液的制备 棘孢木霉活化后，在PDA固体培养基上培养7 d，先用无菌水洗脱孢子后，再用血球计数板计数，置于光学显微镜下观察，配制成浓度为1×108spores/mL的孢子菌悬液，于4℃冰箱保存待用。

将保存于-80℃的洋葱伯克霍尔德细菌在PDA固体培养基活化培养后，挑取单菌落于250 mL的LB液体培养基中28℃ 200 r/min摇瓶过夜培养，待其摇到浑浊后取出，于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 试验设计 将枳壳种子置于0.1%的KMnO4中浸泡2 h，无菌水漂洗3次，播种在灭菌河沙内进行育苗，待出苗后，选择长势一致的枳壳幼苗移栽到花盆(直径15 cm，高10 cm)中，盆中盛装园艺育苗培养基质(经高压蒸汽灭菌法灭菌)，每个花盆1 kg/盆。

移苗后对枳壳进行分组处理，共设4个处理：处理1，接种棘孢木霉(Ta)，移苗10 d后对该组每株枳壳进行灌根接种，接种量为每株20 mL Ta菌丝菌悬液(10 g/L)+20 mL无菌水；处理2，接种洋葱伯克霍尔德细菌(Bc)，移苗10 d后对该组每株枳壳进行灌根接种，接种量为每株20 mL Bc细菌悬液+20 mL无菌水；处理3，接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德细菌(Ta+Bc)，移苗10 d后对该组每株枳壳进行灌根接种，接种量为每株20 mL Bc细菌悬液+20 mL Ta菌丝悬液；处理4，对照(CK)，移苗10 d后对该组每株枳壳进行无菌水浇灌，浇水量为40 mL。处理后的全部枳壳幼苗均置于自然采光的人工大棚中培育，每隔2 d对其进行浇灌无菌水，定期对其进行维护管理。120 d后对其进行各项指标测定。

1.3 考察指标的测定

1.3.1 气体交换及叶绿素荧光的测定 选择晴天10:00～12:00进行测定，采用LI-6400 XT便携式光合作用系统(Li-COR, USA)测定枳壳叶片的气体交换指标。各处理取样3株，每株取第3～4叶序处的功能叶，重复3次。测定时光照强度设为500 μmol/(m2·s)，测定指标包括植物的净光合速率[Pn，μmol/(m2·s)]、蒸腾速率[Tr，mmol/(m2·s)]、气孔导度[Gs，mol/)m2·s)]和胞间CO2浓度(Ci，μmol CO2/mol)等。

采用FS-3000便携脉冲调制式荧光仪对枳壳叶片的叶绿素荧光指标进行测定，各处理取样3株，每株取第3～4叶序处的功能叶，重复3次，记录枳壳叶片的电子传递效率(ETR)以及暗适应30 min之后的最大光化学效率(Fv/Fm)。

用净光合速率除以蒸腾速率得水分利用效率(water utilization efficiency，WUE，100%)；用净光合速率除以当时测定时设定的光强[500 μmol/(m2·s)]得光能利用效率(light use efficiency，LUE，100%)；用净光合速率除以细胞间二氧化碳浓度得瞬时羧化效率[carboxylation efficiency，μmol/(m2·s)]。计算按照GABRIELA等[24]的方法进行。

1.3.2 根系形态指标的测定 将生长120 d后的枳壳植株全部收获，将枳壳植株的根部用清水冲洗干净后，对所有的枳壳植株的根系采用WINRHIZO根系扫描仪器进行扫描，记录其总长度、总表面积、平均直径和总体积的数据，具体细节参照朱艳霞等[25]的方法进行。

1.3.3 生物量的测定 将收获后的枳壳植株装入纸袋中，放入100℃烘箱内杀青10 min，然后在80℃下烘至恒重。取出纸袋和材料，冷却至室温，用分析天平称取枳壳的总干重以及各部位干重(地上部分干重、地下部分干重、叶干重和茎干重)，统计数据以便后期进行分析。

1.4 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 22.0和EXCEL 2019进行数据统计分析，以P=0.05为显著性检验水平。

2 结果与分析

2.1 不同处理对枳壳植株叶片气体交换的影响

2.1.1 枳壳幼苗气体交换 从图1可知，不同处理对枳壳叶片净光合速率、气孔导度、细胞间CO2和蒸腾速率的影响。枳壳叶片净光合速率，Ta与Ta+Bc显著高于Bc和CK。Bc与CK间、Ta与Ta+Bc间均无显著差异。叶片气孔导度，Ta+Bc显著小于其他3个处理，CK、Ta和Bc间差异不显著。枳壳叶片细胞间CO2浓度，接种Bc处理最大，为281.755 6 μmol CO2/mol，显著高于其余处理。CK与Ta间无显著差异，均显著高于Ta+Bc。

枳壳叶片蒸腾速率，Bc最高，显著高于Ta和Ta+Bc，与CK间无显著差异；CK其次，随后依次是Ta和Ta+Bc，三者间均无显著差异。

注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters indicate significance of difference atP<0.05 level.The same kelow.

图1 不同处理枳壳幼苗的气体交换变化

Fig.1 Gas exchange changes ofP.trifoliataseedlings under different treatments

2.1.2 枳壳幼苗水分、光能利用效率及羧化效率 从图2可知，不同处理对枳壳幼苗水分、光能利用效率及羧化效率的影响。枳壳幼苗水分利用效率，Ta+Bc最高，为6.69%，依次为Ta+Bc>Ta>CK>Ta，且差异显著。

光能利用效率，Ta+Bc显著高于CK和Bc，稍高于Ta，Ta+Bc与Ta间、Ta与Bc和CK间差异不显著。

羧化效率，Ta+Bc显著高于Ta和CK，同时，Ta和CK间差异不显著；Bc最低，为0.56μmol/m2·s，但与CK差异不显著。

Fig.2 Water utilization efficency, light utilization efficiency and carboxylation efficiency ofP.trifoliataseedlings under different treatment

2.1.3 枳壳幼苗叶绿素荧光指标 从图3可看出不同处理对枳壳幼苗电子传递速率及最大光合速率的影响。电子传递速率，Bc最高，为34.17；依次为Bc>Ta>Ta+Bc>CK，且差异显著。最大光化学效率，Ta+Bc最高，为0.63；依次为Ta+Bc>Bc>Ta>CK，且差异显著。

2.2 不同处理对枳壳植株根系发育的影响

从图4可看出不同处理对枳壳植株总根长、根总表面积、根平均直径和根体积的变化。幼苗总根长，Ta、Bc和Ta+Bc均显著高于对照，但各接种处理间差异不显著。根总表面积，Bc显著高于其余处理，其余处理间差异不显著。根平均直径，依次为CK>Bc>Bc>Ta+Bc，且差异显著。根体积，Bc略大于Ta，且二者显著大于Ta+Bc；Bc与Ta、Ta与CK间差异不显著，CK显著高于Ta+Bc。

Fig.4 Total root length, total root surface area, average root diameter and total root volume ofP.trifoliataseedlings under different treatment

2.3 不同处理对枳壳植株生物量的影响

从图5可看出不同处理枳壳总干重、地下部总干重、地上部分干重、茎干重和叶片干重的变化。枳壳总干重，Bc与Ta+Bc均显著高于CK和Ta，Ta与CK间、Bc与Ta+Bc间无显著差异。枳壳地下部分干重，Bc显著高于其余处理，Ta显著高于CK和Ta+Bc，CK和Ta+Bc间无显著差异。枳壳地上部分干重，Ta+Bc和Bc显著高于CK和Ta，Ta+Bc与Bc间、Ta与CK间差异不显著。枳壳茎干干重，Ta+Bc显著高其余处理，Bc显著高于Ta和CK，且Ta与CK间无显著差异。 枳壳叶片干重，Ta+Bc与Bc间无显著差异，但二者显著高于CK和Ta，而CK与Ta间无显著差异。

Fig.5 Total dry weight, root dry weight, shoot dry weight, stem dry weight and leaf dry weight ofP.trifoliataunder different treatment

3 结论与讨论

研究结果表明，棘孢木霉单独接种时，其净光合速率高于对照，表明棘孢木霉作为植物的内生真菌，其接种可促进植物的净光合速率，此结果与林燕青等[26]的一致。接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德菌比接种棘孢木霉更能提高其净光合速率，与WU等[27]的研究结果基本一致。接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德菌的枳壳叶片电子传递效率与最大光化学效率均显著高于对照，与WU等[27]的研究结果基本一致。此外，接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德菌时，枳壳的水分、光能利用效率和羧化效率均最高，与范克胜等[28]羧化效率在杨树上的研究结果一致。

有研究表明，棘孢木霉能够促进黄瓜根系的生长[29]，并且当菌根真菌与细菌对植物共同接种时更加能够促进植物的根系发育[27]，与研究相同，接种棘孢木霉和接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德菌时，枳壳的总根长显著高于对照。接种棘孢木霉和接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德菌均能促进枳壳的生物量累积，且接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德菌时，无论在总生物量，还是地上或者地下生物量都显著高于对照。这与JAYANTHI等[30]的研究结果一致。接种棘孢木霉和接种棘孢木霉+洋葱伯克霍尔德菌都促进了枳壳的生长，与宋小双等[31-33]的研究结果一致。

植物根际是十分复杂的微生态系统，菌根真菌—益生菌—宿主植物三者在相互作用中始终保持着极其微妙的微生态系统的动态平衡[33]。菌根辅助细菌可以促进菌根真菌生长、在宿主植物根部定殖形成菌根共生结构，从而促进植物生长，是外生菌根菌际重要微生物类群[34]。研究发现，虽然内生菌根真菌会促进植物的生长[35]，但是许多土壤细菌、根际土壤细菌和菌根根际细菌也能影响外生菌根的共生[36-40]从而促进植物生长。1995年CAROLINE等[41]发现，菌根真菌和植物促生根圈细菌的共同作用会比菌根真菌单独接种更能提高植物的高度。研究对枳壳的部分指标进行了测定，初步探明了洋葱伯克霍尔德细菌作为棘孢木霉的菌根辅助细菌提高了枳壳的光合作用、水分利用效率和光能利用效率，从而促进了枳壳的根系发育，间接地增加了枳壳生物量的累积，最终对枳壳产生促生作用。但是关于其促生作用下更深层次的分子间的相互作用的方式方法还有待进一步研究。