运动训练调节PI3K/AKT信号通路抑制凋亡改善大鼠脑缺血再灌注损伤研究

裴腾勃，阮彩莲，杨彦玲，成蒙蒙

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

在全球范围内，缺血性脑卒中属于致死率和致残率都居高不下的疾病[1]。由于大脑动脉阻塞，长时间严重缺血导致神经细胞丢失、梗死、认知和运动功能障碍，甚至急性死亡，且缺血后的再灌注可以通过激活炎症反应促进细胞凋亡使得组织损伤加重[2]。由于特定有效治疗方法的局限性，为提高卒中患者生活质量改善患者预后，探索出新的有效治疗方法越来越受到人们的重视。相关研究表明，通过运动训练可以提高缺血再灌注大鼠存活率、减少神经缺损、改善血脑屏障功能障碍和增加神经血管完整性，防止更多的神经元受到损伤可以改善脑缺血后的预后[3-4]。运动训练是脑卒中患者的一种治疗措施，它具有神经保护作用[5-6]。运动训练对人类和动物都能起到神经保护作用。然而，神经保护作用背后涉及的信号通路仍然没有得到很好的证实。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),也称AKT信号通路在细胞凋亡中起到重要的作用，PI3K/AKT途径的激活通过增加抑制凋亡蛋白的表达，减少促凋亡蛋白的表达和细胞色素c的释放，从而减少线粒体功能障碍和细胞凋亡[7]。然而，PI3K/AKT通路是否参与运动诱导的脑缺血再灌注神经保护机制尚不清楚。因此，我们设计一系列实验来研究运动训练与PI3K/AKT通路的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠36只，体质量220～280 g，由第四军医大学动物中心提供。饲养条件:温度(22±2)℃，湿度60%,日夜交替,自由饮水和摄食。

1.1.2 主要仪器和试剂 SLY-RTML六道动物跑台(北京硕林苑科技有限公司)，线栓(北京西浓科技有限公司),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂(美国Sigma公司)、HE染色试剂、RIPA裂解液和BCA试剂盒(碧云天生物科技公司),Tunnel染色试剂盒(瑞士罗氏生物科技公司)，磷脂酰肌醇-3-羟激酶(Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)、p-PI3K、AKT和p-AKT一抗(英国Abcam公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 取体重为220～280 g健康清洁级雄性SD大鼠36只随机分为假手术组(Sham，n=12)、模型组(MCAO，n=12)和运动训练组(EX+MCAO，n=12)。

1.2.2 运动训练 运动训练在MCAO术后24 h开始以10 m/min的速度进行平板运动，每天30 min，跑台坡度：0°。Sham和MCAO抓取,但不进行跑台训练。

1.2.3 脑缺血再灌注损伤模型的制备 参照Longa等[8]的方法,应用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。待麻醉成功后,将大鼠仰卧位固定于操作板上,减去颈部细毛并消毒,沿颈正中线切开,钝性分离出右侧颈总、颈外及颈内动脉。结扎颈总和颈外动脉。在颈总动脉剪开一小口,将线栓由开口处插入，经过颈内动脉，至大脑前动脉。逐层缝合并消毒。术后将大鼠置于加热垫上,缺血90 min后拔出线栓,再灌注24 h。假手术组大鼠只分离血管,不插栓线,其他操作相同。

1.3 指标检测

1.3.1 神经功能评分 分别于造模后3 d、7 d、14 d、28 d对各组大鼠进行神经功能学评分。参照Longa等[8]法进行神经功能障碍评分。0分:无神经功能活动障碍;1分:提尾时缺血侧前肢不能伸展;2分:大鼠不能直行,向左侧转圈;3分:行走困难,行走时向左侧转圈、倾倒;4分:严重意识障碍,无法行走或陷入昏迷。4分大鼠不纳入实验。

1.3.2 TTC染色测定梗死体积 造模后28 d，采用颈椎脱位处死大鼠，在20℃下快速保存20 min，借助脑切片机基质切取2 mm厚的冠状切片，取5片冠状切片，在37℃下用2%的2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色15 min。苍白未染色的切片被认为是梗死区的标志，而红色染色的切片则是正常组织的标志。切片固定后拍照。利用Image-proplus 6.0图像分析软件计算大鼠的脑梗死体积,计算梗死组织百分比(梗死脑组织百分比=梗死区体积/大脑体积)。

1.3.3 HE染色检测组织损伤 取大鼠海马组织石蜡切片,用二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,蒸馏水冲洗。然后苏木精中染色5 min,自来水冲洗切片,用盐酸乙醇诱导30 s,自来水冲洗切片,用浓度梯度的酒精进行脱水,随后放于酒精伊红染色液中染色3 min,再次脱水处理,用二甲苯透明,最后滴加中性树胶,进行封片。在400倍光学显微镜下观察海马CA1区神经元的病理变化。

1.3.4 Tunnel染色检测细胞凋亡 用石蜡包埋海马组织，制作冠状切片(4 μm)，每个标本切成5片。采用常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、凋亡检测试剂盒和Tunnel法定量检测神经细胞凋亡。在400倍光学显微镜下随机选取5个视野。正常细胞核呈蓝色，阳性凋亡细胞呈棕黄色，并记录阳性凋亡细胞数。

1.3.5 Western blot法检测 检测大鼠脑组织PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达情况，取脑组织研磨，制备组织匀浆。RIPA裂解液提取各组蛋白，BCA试剂盒检测各组蛋白质浓度。每组取30 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳分离,将分离的蛋白转移至PVDF膜上,脱脂牛奶封闭洗涤后,加一抗4℃孵育过夜,TBST洗膜。将PVDF膜封入二抗稀释液中,室温摇床孵育1 h,TBST洗膜。滴发光液,放凝胶成像仪器内显影。以GAPDH为内参，用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 行为学评价

MCAO组无神经功能缺损。与MCAO组相比，与EX+MCAO组的Longa评分在各个时间点均低于MCAO组，在3 d时间点，Longa评分无明显差异(P>0.05);在7 d时间点，Longa评分出现差异(P<0.05)，且在14 d和28 d时间点，EX+MCAO组Longa评分显著降低，出现明显差异(P<0.01)，提示EX+MCAO组神经功能恢复程度好(见图1)。

2.2 运动训练对MCAO大鼠脑组织梗死体积的影响

染色结果如图2所示,白色部分表示脑梗死区域,红色部分表示非梗死区域。与Sham组比较,MCAO组大鼠脑梗死体积显著增加(P<0.01)。与MCAO组比较,EX+MCAO组大鼠脑梗死体积均显著减少(P<0.01)(见封二图2，表1)。

表1 各组大鼠脑组织梗死体积

注：*与Sham组比较P<0.01；#与MCAO组比较P<0.01

2.3 运动训练对MCAO大鼠脑损伤的作用

与Sham组比较,MCAO组大鼠脑组织出现严重的神经细胞变性坏死,细胞核固缩,细胞与周围组织间隙变大,出现空泡变性,并伴有大量炎症细胞浸润;与MCAO组比较运动训练组大鼠细胞与组织间隙变小,空泡变性减少,炎症细胞浸润也显著减少,EX+MCAO组大鼠脑组织损伤显著减轻,细胞排列较均匀,仅有少量的细胞核固缩(见封二图3)。

2.4 运动训练对MCAO大鼠神经细胞凋亡的作用

Sham脑皮层区细胞结构完整，未见明显凋亡细胞。而在MCAO可以见到大量凋亡细胞，细胞的胞核固缩明显，胞浆浓缩深染，核仁模糊，胞浆及核内染色呈棕褐色。与Sham比较(6.58±0.22)，MCAO组大鼠脑组织神经细胞凋亡率(29.58±4.66)显著升高(P<0.01,)；与MCAO组比较,EX+MCAO组大鼠脑组织神经细胞凋亡率(11.35±2.44)明显降低(P<0.01,)运动训练能抑制MCAO大鼠神经细胞凋亡(见封二图4)。

2.5 运动训练对PI3K/AKT信号通路的作用

与Sham组相比，MCAO组p-PI3K和p-AKT的蛋白表达下降(P<0.05)；与MCAO组相比，EX+MCAO组p-PI3K和p-AKT的蛋白表达明显上升(P<0.05);表明能运动训练促进MCAO大鼠大脑PI3K/AKT信号通路的激活(见图5)。

3 讨论

缺血性脑卒中是一种由于暂时停止或脑血流量不足而引起的脑部疾病。随后的血液再灌注和复氧会进一步加重组织损伤和细胞死亡[9]。缺血性中风由于其高致残率和高死亡率，给患者和社会带来了沉重的负担。由于特定有效治疗方法的局限性，因此，探索出新的有效治疗缺血性脑卒中的方法越来越受到人们的重视。运动训练在脑缺血再灌注损伤中起重要作用，众多研究表明运动训练有神经保护作用。例如，通过运动训练可以提高缺血再灌注老鼠存活率、减少神经缺损、改善血脑屏障功能障碍和增加神经血管完整性，防止更多的神经元受到损伤可以改善脑缺血后的预后[3-4]。

众所周知，大鼠缺血再灌注损伤会导致神经功能评分和脑梗死体积的增加，以及对正常行为结果的抑制[10]。对于神经功能评分和脑梗死体积的检测可有效的反映运动训练的神经保护作用。在实验中，我们发现MCAO组神经功能评分显著增加，EX+MCAO组降低了缺血再灌注引起的大鼠神经功能评分。同时可观察到，MCAO组的梗死体积显著增加，运动训练显著降低了缺血再灌注引起的脑梗死体积。Fang L，等证明[11]小鼠大脑脑缺血再灌注可导致炎症和细胞死亡。从他们的研究结果来看，MCAO组有严重的神经元丢失和神经元死亡，胞浆减少，细胞核固缩。在我们的实验中，HE染色结果显示Sham组中的神经元排列较好，但脑缺血再灌注使MCAO组神经元核固缩，神经元紊乱。EX+MCAO组神经元核固缩比MCAO组明显减少。脑缺血再灌注的大鼠海马神经元细胞凋亡较多，运动训练可减少细胞死亡的发生。我们发现运动训练可以降低大鼠脑缺血再灌注的相关神经元的死亡。Tunnel染色显示MCAO组凋亡细胞明显增多，运动训练组凋亡细胞明显减少[12]。因此，运动训练对大鼠脑缺血再灌注相关脑损伤具有明显的抗凋亡作用。然而，神经保护作用背后涉及的信号通路仍然没有得到很好的证实。

PI3K/AKT信号通路是多种神经细胞的重要生存信号。该途径主要涉及PI3K、AKT及其下游分子。它是细胞内膜受体信号转导和细胞增殖、分化、凋亡等多种过程的重要途径。PI3K/AKT信号在脑缺血再灌注损伤中起关键作用[13]。据报道，许多神经保护因子，在减轻缺血再灌注损伤的过程中，可激活PI3K/AKT信号通路。例如，microRNAs通过激活PI3K/AKT信号通路对大鼠心肌缺血再灌注起保护作用[14]；高良姜素通过介导PI3K/AKT通路减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤[15]。在我们的实验中，我们发现MCAO组比Sham组增加p-PI3K和p-AKT的表达，与MCAO组相比运动训练组更能促进p-PI3K和p-AKT的表达，表明运动训练能明显地激活PI3K/AKT通路。

综上所述，运动训练激活PI3K/AKT信号通路抑制凋亡改善大鼠脑缺血再灌注损伤研究。