海马外泌体中miR-219a-1-3p 对神经干细胞向神经元分化的影响*

李 雯，成 翔，秦建兵，田美玲，何 辉，赵荷艳，金国华*

(南通大学医学院人体解剖学系，神经生物学研究所，南通 226001)

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，存在于发育中的大脑和成年哺乳动物神经系统中[1]。NSCs 通过产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(中枢神经系统的3 种主要细胞类型)来促进神经发生。在成人脑损伤和神经退行性疾病的治疗中，通过促进NSCs 分化来代偿疾病丢失的神经元具有潜在的应用前景[2]。我们先前的研究[3]表明，切断基底前脑隔区神经元向海马的投射纤维后，海马齿状回门区和颗粒下层自体NSCs 表现出强大的增殖能力和神经元分化特征，这与颗粒下层原本处于静息状态的NSCs 被激活密切相关。外泌体是一类直径在40～150 nm 之间的细胞外微囊泡，在过去的10 余年中受到了科学的关注[4]。最近，从哺乳动物细胞释放的外泌体被报道为一种细胞间通信的新载体，因为它可将脂质、蛋白质、mRNA、非编码RNA 甚至DNA 转运到其他细胞，在各种干细胞微环境中发挥重要作用[5]。在此背景下，我们利用高通量测序技术检测去胆碱能神经支配后海马外泌体内转录本的表达变化，发现切割组外泌体中miR-219a-1-3p 显著下调。为了更好地研究miR-219a-1-3p 与海马外泌体促进NSCs 向神经元分化之间的关系，本研究应用实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,Realtime PCR)、Western Blot 和免疫荧光等方法，对海马外泌体miR-219a-1-3p 的下调进行了验证，并检测了miR-219a-1-3p 在大鼠全身多组织、细胞的表达情况以及对NSCs 分化为神经元的影响，为更好地研究NSCs 的分化提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物 实验所用胚龄15 d SD 大鼠和220～250 g 成年SD 大鼠由南通大学实验动物中心提供[动物许可证编号：SYXK(苏)2012-0031]。动物实验由南通大学实验动物伦理委员会批准，并按照实验动物饲养管理和使用指南进行。实验过程中尽可能减少实验动物使用数量，减轻实验动物痛苦。用复合麻醉剂Chlorpent(0.2 mL/100 g 体质量)麻醉大鼠后行穹隆海马伞切割术，无菌条件下切开颅顶部皮肤，分离骨膜以充分暴露前囟，记录前囟A(矢状轴)、L(冠状轴)和V(垂直轴)的坐标，参照Paxinos《大鼠脑立体定位图谱》确定双侧穹窿海马伞的切割范围。先在颅骨上确定左侧两点，即(1)A1=A-1.4、L1=L+1和(2)A2=A-1.4、L2=L+4，再确定右侧两点，即(3)A3=A-1.4、L3=L-1 和(4)A4=A-1.4、L4=L-4；然后用颅骨钻在每点位置各钻一小孔，(1)、(2)和(3)、(4)两点间用刀片分别划开一条骨缝，将针刀插入脑内，深度为V=V+5.4，针刀来回切割3 次后退出，待无明显出血后用骨蜡封闭骨缝。最后，缝合皮肤，肌注青霉素，放回笼内饲养。

1.2 海马微环境总外泌体提取 切割术后7 d，无菌条件下依次剥离大脑表面被膜和血管，分离并提取海马组织，加入2 mL 0.125%的胰蛋白酶，轻轻吹打成匀液，将上清液转移至50 mL 离心管中，加入0.1 mol/L(pH 7.4)磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)复悬至30 mL，4 ℃3 000 g 离心30 min以除去碎片，将上清液转移至新的50 mL 离心管；用220 nm 滤器过滤上清至30 ku 超滤管中，将浓缩上清液转移至EP 管中，加入等体积的Total Exosome Isolation 试剂，涡旋混匀，4 ℃过夜；将样品以4 ℃10 000 g 离心1 h，弃上清，加入适当体积PBS 将沉淀重悬。部分外泌体标本送上海烈冰生物医药科技有限公司进行RNA-seq 检测。

1.3 胚胎海马NSCs 分离培养及体外诱导分化 胚龄15 d SD 大鼠，腹腔注射复合麻醉剂，无菌条件下取出胚胎，置于基础培养液(无血清DMEM)中，分离出海马，机械解离成单细胞悬液，离心后弃上清，用增殖培养液[DMEM/F12 1∶1,2% B27,20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),20 ng/mL 表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)]重悬，以密度(2～5)×105个细胞/T25 培养瓶种植。6～7 d 后将形成的神经球消化传代，种植于分化培养液[DMEM/F12 1∶1,2% B27,2%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)]中诱导分化，密度为5×104个细胞/mL，贴壁过夜后换液，将正常组和切割组海马外泌体分别与NSCs 共培养，或分别将miR-NC 和miR-219a-1-3p mimic 转染至NSCs 中进行诱导分化。

1.4 神经元和星形胶质细胞的分离培养 胚龄15 d SD 大鼠，腹腔注射复合麻醉剂，无菌条件下取出胚胎，置于基础培养液中，分离出大脑皮质，机械解离成单细胞悬液，离心后弃上清，培养神经元用神经元培养液(neurobasal,2 mmol/L 赖氨酸,2%B27)重悬，以密度2.8×106个细胞/10 cm 培养皿种植，6～7 d 后收集细胞提取RNA；培养星形胶质细胞用星形胶质细胞培养液(DMEM/F12 1∶1,10%FBS)重悬，3～4 d 后传代，传至第4 代时收集细胞提取RNA。

1.5 Real-time PCR 取3 只成年SD 大鼠，麻醉后取端脑、小脑、脑干、海马、心脏、肝脏和肌肉组织，分别用研磨器在Trizol 中研磨提取RNA；培养的细胞则用Trizol 直接裂解，提取总RNA。按照HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme Biotech 公司)说明书将1 μg 总RNA 逆转录成cDNA。按照Fast Start Universal SYBR Green Master(Roche)说明书，在StepOnePlusTMrealtime PCR 仪(Applied Biosystems 公司)中进行Realtime PCR，数据用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计分析。实验所用引物由Sangon Biotech 和RiboBio 公司设计。

1.6 Western Blot 用蛋白提取试剂盒(Pierce 公司)提取细胞总蛋白，测定浓度后进行凝胶电泳，Bio-Rad 半干转印系统转膜，5%脱脂奶粉将膜室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。次日二抗室温孵育2 h，通过增强化学发光试剂盒(Bio-Rad 公司)进行显像。用Shine-tech Image System 扫描并量化每个条带的光密度值。实验所用一抗：鼠抗Tuj1 单克隆抗体(1∶1 000,Millipore 公司)，鼠抗β-actin 单克隆抗体(1∶1 500,Abcam 公司)；二抗：辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000,Pierce 公司)。

1.7 细胞免疫荧光 细胞爬片经4%多聚甲醛室温固定30 min，用含有0.3%Triton X-100 和0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的0.01 mol/L PBS(pH7.4)室温封闭2 h，加入一抗4 ℃过夜。次日用二抗在室温下避光孵育2 h。细胞核用Hoechst33342(1∶1 000,Pierce 公司)复染，PBS 清洗后甘油封片。实验所用一抗为鼠抗Tuj1 单克隆抗体；二抗为Alexa Fluor 488 缀合的(绿色)山羊抗鼠IgG(1∶1 000,Abcam公司)。

2 结 果

2.1 大鼠海马外泌体促进NSCs 向神经元分化 为了探究海马组织外泌体在NSCs 分化中所起的作用，本实验分别用Real-time PCR、Western Blot 和细胞免疫荧光进行检测。Real-time PCR 检测关键的神经元特异分子，结果显示，共培养24 h 后切割组Map2、Neurod1、Stmn2 和Syn1 表达开始显著上调(图1A，见封三)。Western Blot 结果表明，切割组Tuj1 蛋白表达量明显上调(图1B，见封三)。细胞免疫荧光检测发现切割组Tuj1 阳性神经元比例明显上调(图1C，见封三)，据此认为切割组海马组织外泌体可促进NSCs 向神经元分化。

2.2 大鼠海马外泌体RNA-seq 及验证 外泌体RNA 测序显示有24 个差异表达的miRNA，其中9个上调，15 个下调(图2A～B)。Real-time PCR 结果显示，与正常海马外泌体相比，切割组外泌体中miR-219a-1-3p 表达下调(图2C)。

2.3 miR-219a-1-3p 在大鼠多组织细胞中的表达Real-time PCR 检测miR-219a-1-3p 在成年大鼠的端脑、小脑、脑干、海马、心脏、肝脏和肌肉组织中的表达，结果显示miR-219a-1-3p 在端脑和海马中的表达显著高于其他组织，且在端脑中表达最高(图3A)。Real-time PCR 检测miR-219a-1-3p 在NSCs、神经元和星形胶质细胞中的表达，结果如图3B 所示，miR-219a-1-3p 在星形胶质细胞中表达最低，在NSCs 中表达最高。

2.4 miR-219a-1-3p 对NSCs 向神经元分化的影响为了探究miR-219a-1-3p 在NSCs 分化中的作用，我们用mimic 进行转染，Real-time PCR 检测其过表达效率，结果显示，过表达组miR-219a-1-3p 水平显著上调(图4A，见封三)。接着对Map2、Neurod1、Stmn2 和Syn1 进行分析，结果表明4 个关键的神经元特异分子均显著下调(图4B，见封三)。如图4C(见封三)所示，在miR-219a-1-3p 过表达组中，Tuj1 蛋白的表达水平显著下调。免疫荧光分析显示，过表达组的Tuj1 阳性细胞少于对照组(图4D，见封三)。总之，这些结果表明miR-219a-1-3p 过表达抑制了NSCs 分化为神经元。

3 讨 论

神经可塑性即损伤后中枢神经系统自我修复的能力，强烈依赖于神经发生[6-7]，假如能够找到有效的方法促进海马内源性神经元再生与分化，或通过外源性手段补充丢失的神经元，就可促进神经系统功能恢复，从而有效预防和治疗各种疾病所致的认知功能障碍。海马齿状回的颗粒下层在整个生命过程中都有神经发生的潜力[8]。本课题组先前的研究[3]表明，切割穹窿海马伞阻断隔区神经纤维向海马齿状回的投射后，海马结构内局部微环境的改变在一定时间内为NSCs 的存活、增殖和向神经元分化提供了有利条件。

外泌体是细胞外囊泡的亚型，具有独特的结构特征和生物学功能。鉴于外泌体在细胞间通讯中可作为介质传递重要蛋白[9]、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)[10]和微小RNA(microRNA,miRNA)[11-14]，调节淀粉样蛋白前体(amyloid precursor proteins,APP)和tau 蛋白的表达和功能，提示外泌体具有在临床前阶段用作诊断的生物标志物的潜力以及它们用于调节神经变性的可能性[15]。自从2007年首次报道外泌体以来，外泌体来源的RNA 研究迅速增加。研究[16]表明，外泌体及其供体细胞的RNA 谱存在显著差异。如致癌的miR-21 表达通过外泌体被上调和分泌，从而促进了许多恶性肿瘤的进展和转移[17]。

本研究将海马的外泌体与NSCs 共培养，观察它们对NSCs 分化的影响。结果表明，NSCs 与切割组去神经支配的海马外泌体一起孵育，可促进更多的NSCs 分化为神经元。利用高通量测序技术观察去神经支配后海马外泌体内转录本的表达变化，结果显示共有24 个miRNA 表现为转录激活状态。鉴于在发育过程中miRNA 的表达受到调控，表现为在某一组织和细胞类型中富集，因此我们选取了发育自3个胚层的7 种组织及NSCs、神经元和星形胶质细胞检测差异miRNA 的表达水平。尽管在神经系统中表达水平低的miRNA 也可能具有功能，但我们认为高表达的miRNA 更有可能在神经生物学过程中起着至关重要的作用，因此主要关注miR-219a-1-3p。接着在海马NSCs 中过表达miR-219a-1-3p，结果显示过表达miR-219a-1-3p 抑制了NSCs 向神经元的分化，该结果和切割组外泌体(较正常组外泌体中的miR-219a-1-3p 明显下调)与NSCs 共培养获得的促进NSCs 向神经元分化的结果一致。

围绕本研究尚需要进一步探讨的问题还有miR-219a-1-3p 靶向于调控NSCs 分化的mRNAs有哪些？相关的信号传导途径是什么？miR-219a-3p对NSCs 分化为特定表型神经元(如胆碱能神经元)有什么影响？外泌体中还有哪些非编码RNA 与NSCs向神经元的分化有关等。阐述这些问题将为揭示NSCs 分化机制和将外泌体应用于神经退行性疾病的治疗提供线索和新思路。