环状RNA 在肝癌进展中的作用及其潜在价值*

姚 敏，杨 婕，姚登福

(1 南通大学医学院免疫学系，南通 226001；2 南通大学生命科学学院；3 南通大学附属医院临床医学研究中心)

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)仍是长江口地区的主要恶性肿瘤之一[1]。肝癌根治性治疗方法包括手术切除和射频消融等，但大多数患者诊断时已属于中、晚期，失去了良好的治疗机会[2-3]，小分子核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的基础与临床研究中，显示非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)与慢性肝病恶性转化、肝癌早诊、早治及患者预后等密切相关。庞大的ncRNA 家族包括22 bp 的微小RNA(microRNA,miRNA)、20～25 bp 的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA 或RNAi)、约150 bp 的小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)、≥200 bp 的长链非编码RNA(long ncRNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)等[4]。circRNA 作为ncRNA家族的重要成员，因其环状结构高度稳定、肝癌组织丰度高及组织相对特异等，参与慢性肝病恶性转化，其表达改变有望成为肝癌早诊与预后评估的新标志或有效治疗的新靶点[5]。本文述评了circRNA 在肝癌进展中的潜在价值。

1 CircRNA 生物合成及特点

与线性RNA 不同，circRNAs 为连续闭环结构，缺少1 个聚腺苷酸化(polyA)尾部和5′帽，由前信使RNA(mRNAs)反向剪接或外显子跳跃产生，且直接反向剪接比外显子跳跃更频繁[6]。按其组成分为4类：外显子环状RNA(exonic circRNA,E-circRNAs)、外显子/内含子环状RNA(exon-intron circRNAs,EIciRNAs)、环状内含子RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)和tRNA 内含子环状RNA(tRNA intronic circular RNAs,tricRNAs)。公认环状RNA 生物合成，RNA 结合蛋白(RNA binding protein,RBP)介导的、内含子对驱动的和套索驱动，在调节相邻剪接位点促进环状生物合方面具有重要作用[7-8]。

存在于肝组织或细胞中的circRNA 为非多聚腺苷酸化的、单链的、共价闭合的环状RNA，因缺少5′或3′末端不易被核酸外切酶作用，比线性RNA 或其它核酸更稳定；肝癌组织circRNA 表达丰度高，比线性mRNA 高数倍以上；circRNA 序列保守，有一定的组织特异性[9]；从生物信息学挖掘的RNA 测序数据分析，在哺乳动物基因组中，超过20%的细胞能产生circRNA，且呈多样性，在细胞分化和调节信号通路中扮演关键角色[10]。

2 CircRNA 功能与机制

CircRNA 在表观遗传、转录和转录后调控水平上发挥作用，外显子源性circRNA 大多位于胞浆中发挥作用，ciRNA 及EI-ciRNA 大多在胞核中发挥作用，主要方式有：(1)ciRNA 定位在细胞核内，与RNA 聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ,Pol Ⅱ)结合促进其亲本基因表达；(2)EI-ciRNA 定位于胞核与U1 核内小核糖核蛋白质(U1 small nuclear ribonucleo proteins,U1 snRNP)结合形成复合物，再与Pol Ⅱ转录复合物结合于亲本基因启动子上，促其亲本基因转录；(3)外显子源性circRNA 多数存在于胞浆的miRNA 海绵(miRNA sponge)发挥作用；(4)circRNA 直接或间接与RNA 结合蛋白形成RNA-蛋白复合物(RNA-protein complex,RPC)，与基因线性转录物相互作用；(5)部分circRNA 含核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)可译成蛋白质，可见circRNA 既是DNA与编码蛋白间信使，也具阻止其他RNA 链翻译形成蛋白质的功能[11-12]。

竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的miRNA 海绵作用，即ceRNA 特征RNA 分子的生物学功能，通过数量和种类不等miRNA 反应元件(microRNA response element,MRE)竞争性结合miRNA，降低miRNA 对其靶标的抑制作用。肝circRNA 因表达丰度高半衰期长，是一类强大的ceRNA 分子。经典RNA 测序法能分离具有特征性分子“尾巴”的分子。circRNA 有多个miRNA 结合位点，发挥海绵样吸收miRNA 作用。circRNA 通过miRNA反应元件竞争性地与miRNA 结合，在转录后水平上减少结合mRNA 的miRNA 数量并调控miRNA 下游靶基因表达。对circRNA 海绵在HCC 发病中的作用机制认识，将有助于筛选HCC 诊断标志物和研发治疗的有效靶点[13-14]。

3 CircRNA 在肝癌进展中的作用

采用circRNA 微阵列、荧光定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)等技术，研究肝癌患者癌组织和外周血显示肝癌circRNA 过表达，在肝癌进展中主要有促进[15-19]和抑制[20-24]作用。最近研究发现部分circRNA 的海绵作用见表1。肝癌circRNA 通过分子海绵作用，经微小RNA 靶向目标基因发挥抑制、促进肝癌细胞增殖或肝癌生长如circRNA_000839 通过与miR-200b 和RhoA 相互作用影响肝癌的进展。

表1 几种肝癌相关circRNA 与miRNA 分子海绵作用

根据生物信息学构建的circRNA-miRNA 相互作用网络分析，circRNA 作用方式有：(1)circRNA 直接靶向目标基因，如hsa_circ_0001649 是在SHPRH(SNF2 histone linker PHD RING helicase)基因座第26 个外显子和第29 个外显子间产生，SHPRH 定位于人类染色体6q24 上，是SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)复合物家族的成员(抑癌基因)，它可直接靶向SHPRH 基因发挥抑癌作用[20]；(2)circRNA 经单一miRNA 靶向基因，如癌组织CircC3P1 是由C3P1(complement component 3 precursor pseudogene)基因第27 至第29 个外显子间产生的，可通过对miR-4641 海绵作用促进PCK1 表达，而发挥抑癌作用[25]；(3)circRNA 可同时作用于多个miRNA，再靶向目标基因，如癌组织cSMARCA5(hsa_circ_0001 445)表达下调，充当miR-17-3p 和miR-181b-5p 分子海绵促进抑癌基因TIMP3 表达，抑制肝癌细胞增生和转移[26]；circZFR 则与miR-511-5p、miR-130b-5p、miR-642a-5p、miR-532-3p 及miR-329-5p 相关联合发挥促进肝癌进展的分子海绵作用[27-28]。

4 CircRNA 作为肝癌标志物

甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是肝癌筛查常用血清学检查，因灵敏度低早期肝癌易漏诊，迫切需要新标志物以提高早期肝癌检出率。细胞和组织中广泛存在、以共价闭合外显子环形化结构形成的circRNA，在生理和病理过程中发挥重要的调控作用。从5 例HCC 的10 个样本测序建立的肿瘤相关数据库(CCRDB)中，共11 501 个circRNA[29]，经筛选has_circ_0002130，has_circ_0084615，has_circ_00014 45，has_circ_0001727 和has_circ_0001361 及相应基因或染色体位点，可能是诊断的潜在生物标志物。几种circRNA 对肝癌诊断的临床价值见表2[29-35]，尽管不同研究样本间存在异质性，采用随机效应模型的Meta 分析circRNA，显示对肝癌诊断的灵敏度为0.82，特异性为0.72，综合受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.84，提示circRNA是有助于HCC 诊断与鉴别的分子标志物[36-37]。

表2 几种circRNA 异常表达对肝癌诊断的临床价值评估

AUC 在诊断的灵敏度和特异性方面，circRNA优于AFP。circRNA 和血AFP 联检，具有互补诊断价值，如AFP 结合Hsa_circ_0003998，诊断灵敏度可达94.7%[31]。以circRNA 微阵列技术分析组织中hsa_circ_0000130 的表达，显示肝癌组织明显高于自身对照的癌周组织，低表达肝癌患者的累计生存率为72.0%，显著高于高表达者的42.9%；经单因素/多因素回归分析显示CDRlas 是肝癌微血管侵袭(microvascular invasion,MVI)独立危险因素[38]，预测MVI的AUC 为0.68。稳定的circRNA 具有相对组织特异性，与肝癌的恶性程度及预后密切相关。

5 肝炎病毒相关的circRNA 表达

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关肝癌，仍是长江口地区肝癌发生的主要病原学因素，因HBV 共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)维持病毒持续感染。除临床HBV 标志物外，血HBV-RNA 可用于抗病毒治疗和预测患者干扰素的易感性，它的剪接变异体和cccDNA 表观修饰与HBV 相关肝硬化、HCC 进展有关[39]。基于癌组织微芯片的研究，HBV 相关HCC组织circRNA表达比癌周组织高2.0 倍(P＜0.05)上调circRNA 24种，显著下调23 种；再以qRT-PCR 筛选出6 种为候补circRNA(hsa_circRNA_102814,100381,103489,101764,100327 和103361)，经癌组织验证hsa_circRNA_100381 和hsa_circRNA_103489 显著上调，hsa_circRNA_101764下调最为显著，尤其与miR-181 家族共表达，提示在HCC 进展中起重要作用[40]。

在疾病发展过程中内源性circRNA 起着至关重要的作用，circRNA 具有分子海绵功能，吸附或隔离特定的微小RNA 去抑制靶基因mRNA。采用基因芯片技术分析了HBV 相关肝癌及对应非癌肝组织circRNA 图谱，根据海量数据鉴定出上调222 567 556个和下调125 439 219 个，显示circRNA 共5 396 个分支，数以万计的circRNA 参与肝癌进展[41]。因circRNA 稳定性高于线性RNA，在体外可设计circRNA微型海绵模型系统，如丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)在生命周期中需细胞中miR-122。利用体外合成circRNA 的海绵作用，能有效吸附miRNA-122 达到抑制HCV 复制的目的，提示设计定位于胞质和胞核且稳定的circRNA，可有效抑制肝炎病毒复制，值得深入研究[42]。

6 CircRNA 过表达与肝癌预后

化疗耐药是HCC 预后不佳的因素。肝癌组织circRNA 的研究文献较多，呈过表达和低表达状态。主要与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和TNM 分期等临床病理学特征有关。以circRNA 芯片技术筛选肝癌组织中差异表达的circRNA，位于第13 号染色体的周期蛋白依赖性激酶8 是circRNA101237 的靶基因。癌组织或患者血circRNA101237 均显著高于癌旁或对照组血。单变量和多变量分析显示血清circRNA101237 水平是肝癌患者生存预后的独立预测指标，高表达患者总生存率降低。体外研究[43]发现顺铂以剂量和时间依赖方式诱导肝癌细胞circRNA101237 表达，而顺铂耐药患者和耐药huh7 细胞中该circRNA 过表达。肝癌奥沙利铂(oxa)耐药中circRNA 的作用，肝癌组织circfbxo11 显著上调，过表达与患者预后不良有关。circfbxo11 能促进HCC增殖、进展和oxa 抵抗，其机制可能为定位于细胞质中circfbxo11 分子沉重海绵miR-605 靶向foxo3 蛋白。foxo3 针对ABCb1 启动子区加速表达。circfxo11/miR-605/foxo3/ABCb1 轴在肝癌多药耐药中作用[44]。

7 CircRNA 与肝癌靶向治疗

肝癌相关circRNA 数量庞大，通过过表达或低表达促进或抑制肝癌细胞增殖或肿瘤生长。癌细胞和癌组织circ-homer1 过表达，与患者瘤体大小、淋巴结转移、高临床分期和预后差密切相关；其分子机制为circ-homer1 经miR-1322/cxcl6 轴，促进肝癌细胞生长和侵袭性；反之，沉默可干预circ-homer1 活化，增强miR-1322 作用于cxcl6，而抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭、细胞凋亡增加[45]。肝癌患者的血浆外泌体和肝组织来源circ-0051443，通过竞争结合miR-331-3p 上调BAK1 表达，促进癌细胞凋亡和细胞周期阻滞，抑制癌细胞的生物学行为；体内研究证实circ-0051443 对BAK1 的调控作用，发挥对裸鼠肝癌移植瘤生长的抑制作用[46]。另一研究[47]也显示癌组织或细胞中has_circ_0008450 过表达，通过调节miR-214-3p/ezh2 轴，发挥抑制肝癌进展作用。敲除肝癌HepG2 和Huh-7 细胞中circMAN2b2 的表达，经海绵癌胚型miR-217 作用，调节丝裂原活化蛋白激酶1 活性而发挥抑癌作用[48]，期待在众多circRNA中发现肝癌有效治疗的分子靶目标。

8 展 望

肝癌发病率持续上升仍是基础医学和临床医学的重大挑战，肿瘤相关circRNA 是近年ncRNA 的研究的热点之一。具有独特性和多种病理生理功能的circRNA，日益受到重视[5,49]。目前对circRNA 的研究主要集中在作为有效分子海绵的功能上，因circRNAs 非常稳定，高度保守，其表达改变与肝癌分期、肿瘤大小、分化程度、转移等进展有关。已证明has_circ_0004018 和has_circ_0005075 等为肝癌诊断和靶向干预的潜在标志物。随着高通量RNA 测序技术的发展，越来越多肝癌相关、结构多样的circRNA被发现，对复杂分子调控机制阐明、期待circRNA 成果即时转化、基于circRNA 的肝癌诊断与治疗等具有开发应用前景。