高压氧治疗对小鼠慢性炎症性疼痛和组织水肿的影响*

朱鸣镝，赵林霞，高永静

(1 南通大学附属医院骨科，南通 226001；2 南通大学特种医学研究院)

高压氧治疗(hyperbaric oxygen therapy,HBOT)是指在高压(超过常压)的情况下，吸入纯氧以治疗缺氧性疾病和相关疾病的方法。HBOT 在临床上有多种适应证，包括心脑血管疾病、中毒性疾病、感染、自身免疫性疾病等。近年来，HBOT 也用于治疗慢性疼痛，包括慢性头痛、纤维肌痛、复杂性区域疼痛综合征、三叉神经痛等[1]。实验动物研究[2-4]表明，高压氧治疗减轻了脊神经结扎或坐骨神经慢性压迫性损伤引起的神经病理性疼痛、角叉菜胶引起的急性炎症性疼痛、完全弗氏佐剂诱导的慢性炎症性疼痛。但对于高压氧镇痛的机制研究还较少。

慢性炎症性疼痛是临床常见的慢性疼痛，表现为自发性疼痛、热痛觉过敏和机械性触诱发痛。慢性疼痛的产生与外周神经系统和中枢神经系统神经元的可塑性变化密切相关，同时神经元的可塑性变化也受到胶质细胞释放的炎症介质的调控[5]。以往的研究[6]证实，表达于神经元或胶质细胞内的多种激酶参与炎症介质的表达和释放。在慢性疼痛状态下，有丝分裂原蛋白激酶家族，包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)，c-Jun N 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及p38 在脊髓的神经元或胶质细胞中表达升高，而鞘内注射这些激酶相应的抑制剂有效缓解了慢性疼痛。另外，辣椒素受体瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels,TPRV1)是表达在背根神经节并在疼痛中起重要作用的受体[7]。但在慢性炎症性疼痛情况下，ERK、JNK 和TRPV1 是否在外周组织中被激活，以及HBOT 对它们激活的影响缺乏研究。我们采用小鼠足底注射完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant,CFA)诱导慢性炎症性疼痛，结合2 个大气压的高压氧治疗，探讨HBOT 对于CFA 诱导的痛觉过敏、组织水肿、以及对ERK、JNK 激活和TRPV1 表达的影响。

1 材料和方法

1.1 动物和造模 雄性ICR 小鼠(体质量20～30 g)购自南通大学实验动物中心。小鼠饲养于SPF 级动物房，室温(23±2) ℃，自由摄食和饮水。造模时，小鼠用异氟烷吸入麻醉，之后在小鼠左侧后爪足底皮下注射20 μL CFA。实验经南通大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂 CFA(Sigma-Aldrich 公司)；蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich 公司)；双辛酸(bicinchonininc acid,BCA)法蛋白定量检测试剂盒(Bio-Rad 公司)；p-ERK 抗体(Cell Signaling Technology)；p-JNK(Cell Signaling Technology)；TRPV1 抗体(Santa)；β-actin 抗体(Sigma-Aldrich 公司)。

1.3 高压氧处理 用于行为学检测的小鼠高压氧处理方式：(1)在CFA 注射后1 h 首次将小鼠置于小动物高压氧舱[100%氧气，2 个大气压(atmosphere absolute,ATA)]之后每天1 h，连续8 d；对照组置于常氧常压环境1 h，处理时间同上；(2)CFA 注射后3 d首次将动物放置于高压氧环境或常氧常压环境1 h，连续5 d。用于检测足底炎症程度和Western Blotting的小鼠，处理方式同(1)。

1.4 行为学检测 使用IITC model 390 痛觉测量仪进行检测。在实验前3 d，小鼠每天置于热痛仪恒温玻璃板上的透明有机玻璃盒中1 h，使之适应环境。测试时，将玻璃板温度设置为30 ℃，调节光照强度，使正常小鼠的潜伏时间10～14 s。待小鼠安静后，将光照点对准小鼠左后肢爪的爪中心位置，开始计时。待小鼠出现缩腿或舔爪时计时停止，该时间段为小鼠的缩腿潜伏时间。每只小鼠重复测量3 次，每次相隔大约5 min，取3 次的平均值作为小鼠缩腿潜伏期，数值越低表示小鼠热痛过敏越严重。足底肿胀程度检测采用plethysmometer(UgoBasile,Camerio,VA,Italy)，将小鼠轻轻抓住，将炎症足踝关节以下置于测试仪的液体中，记录仪器上显示的数值。

1.5 Western Blot 将正常小鼠，CFA 后1、3 和7 d的高压氧处理组和对照组小鼠，在异氟烷吸入麻醉下，经左心室灌注生理盐水30 mL，之后取足底皮肤，加入蛋白裂解液提取蛋白，经BCA 测定蛋白浓度。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳(Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，蛋白上样量30 μg。待电泳完成后，转至PVDF 膜，用5%脱脂牛奶封闭，之后加一抗(兔抗p-ERK，1∶500；兔抗p-JNK，1∶500；山羊抗TRPV1，1∶500；鼠抗β-actin，1∶5 000)孵育过夜。之后加相应二抗，显影后扫描。

1.6 统计学方法 数据分析使用GraphPad Prism 5软件，行为学结果用双因素重复测量方差分析(Twoway RM ANOVA)。Western Blot 中的条带采用Image J 测量灰度，以β-actin 做内参。两两比较采用Student′s t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高压氧缓解CFA 诱导的热痛觉过敏 CFA 注射后1 h，给予小鼠2 个ATA 的高压氧处理，之后每天1 次，连续8 d。在每次高压氧处理后的3 h，检测热痛觉过敏。结果显示，高压氧处理3 次之后，小鼠对热刺激的缩腿潜伏期显著增加；而且在CFA 后的第8 天，高压氧治疗停止后，疼痛程度仍显著低于对照组。到CFA 后14 d，两组动物的缩腿阈值均恢复正常(图1A)。在CFA 3 d 开始高压氧治疗的动物，连续5 d 的治疗，疼痛均缓解，在高压氧停止后1 d 仍有效(图1B)。表明在CFA 注射后的当天或3 d 开始给予高压氧治疗，均能有效缓解CFA 引起的炎症性疼痛。

2.2 高压氧缓解CFA 诱导的足底组织肿胀 CFA注射后1 h 给予高压氧治疗，连续8 d。在疼痛行为检测结束后检测足底体积。如图2 所示，在第4 次治疗后，高压氧组小鼠足底水肿程度显著低于对照组。在第8 天停止高压氧治疗后(CFA 后10 d 和14 d)，足底水肿仍低于对照组(P＜0.001,n=6)，表明HBOT显著且长时间缓解CFA 引起的组织水肿。

2.3 高压氧降低CFA 引起的p-ERK、p-JNK、TRPV1 在足底的表达 在CFA 后的1、3 和7 d 取皮肤组织进行Western Blot。结果显示，CFA 注射引起足底皮肤磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化JNK(p-JNK)和TRPV1 表达显著增加，p-ERK 从注射后1 d 持续到3 d；p-JNK 和TRPV1 从1 d 持续到7 d。高压氧处理后1 d，p-ERK、p-JNK 和TRPV1 的表达与对照组相比无显著变化，但3 d 和7 d，以上3 种蛋白的高压氧处理组比对照组显著下降(图3)，表明高压氧有效降低了p-ERK、p-JNK 和TRPV1 在皮肤的表达。

3 讨 论

高压氧治疗是一种非侵入性治疗方法，安全性和有效性均较高，而费用较低。多种动物实验和临床治疗都体现了HBOT 镇痛的有效性。与这些结果类似，我们也检测到HBOT 有效缓解了CFA 引起的慢性炎症性疼痛，且无论在炎症初期(CFA 注射当天)还是维持期(CFA 注射后3 d)，HBOT 均能缓解热痛觉过敏。同时，重复给予HBOT 并未出现耐受性，并在HBOT 停止后疼痛缓解仍持续一段时间，这些结果证明HBOT 是一种有效的镇痛方法。

以往的研究[8]表明，慢性疼痛伴随中脊髓水平胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)的激活，同时p-JNK 和p-p38 分别在脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞中特异性表达；而ERK 在不同的疼痛模型及不同的时间点可分别与神经元、星形胶质细胞或小胶质细胞。JNK、p38 和ERK 的激活诱导下游的炎症因子的表达，从而促进神经炎症反应[8]。我们曾经证明，HBOT 抑制了CFA 诱导的脊髓中星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，同时抑制了p-JNK、p-p38 和p-ERK 在脊髓的表达。而且HBOT 也降低了CFA 诱导的脊髓中多种炎症因子的表达上调，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、单核细胞超化蛋白1 和干扰素诱导蛋白1。在体外培养的星形胶质细胞和小胶质细胞，LPS 刺激诱导了多种细胞因子和趋化因子的上调，而HBOT 预处理则使这些因子的上调显著性下降[2]。也有研究[4]证明，HBOT 不但抑制了神经损伤引起的脊髓中星形胶质细胞的激活，还抑制了背根神经节、海马中星形胶质细胞的激活，并降低了这些组织中TNF-α 的上调。这些结果表明HBOT 可作用于中枢神经系统及外周的背根神经节，抑制神经炎症反应，从而缓解慢性疼痛。因此，本研究中HBOT 的镇痛作用也可能与抑制背根神经节和脊髓的炎症有关。同时，我们检测到HBOT 处理抑制了CFA 引起的皮肤中JNK 和ERK 的激活，推测HBOT 也能作用于外周组织，抑制外周炎症反应。

红、肿、热、痛是组织炎症的重要特征，炎症因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6 在组织水肿的产生中发挥重要作用，能增加血管的通透性，促进白细胞的迁移。巨噬细胞是炎症因子的主要来源。很多证据[9-10]表明，脂多糖刺激巨噬细胞能使炎症因子表达增加，并激活JNK、ERK、NFκB 等细胞内激酶的激活。采用多种药物抑制JNK、NFκB 时，巨噬细胞释放的炎症因子减少，外周组织中的炎症因子表达和水肿也被抑制[10-11]。本研究中HBOT 降低了局部组织JNK 和ERK 的激活，而且明显缓解了组织水肿，我们推测HBOT 可能通过抑制巨噬细胞中JNK 或ERK 介导的炎症因子表达而抑制水肿，相关机制还需要以后继续进行深入研究。

TRPV1 是一种非选择性的阳离子通道，可被辣椒素、质子、膜来源的脂类及伤害性热刺激所激活。TRPV1 主要表达于外周伤害性神经元，但药理学研究[12-14]显示，全身性或中枢性给予TRPV1 拮抗剂缓解炎症性疼痛、神经病理性疼痛和术后疼痛。最近研究[15]表明，TRPV1 拮抗剂注射到损伤神经或该神经所支配的后爪能缓解神经损伤诱导的热痛觉过敏，支持TRPV1 在外周参与痛觉过敏。由于TRPV1 通道的开放，促进钙离子的内流，从而激活JNK 和ERK[16]，因此HBOT 可能通过抑制TRPV1 的表达抑制JNK 和ERK 的激活，从而发挥抗炎和镇痛作用。

综上所述，采用CFA 诱导的小鼠慢性炎症性疼痛模型结合高压氧治疗的结果证实了HBOT 对疼痛和局部组织水肿的缓解作用，而且可能与抑制外周组织中TRPV1 的表达及ERK 和JNK 的激活有关。本研究为临床上使用高压氧治疗慢性疼痛提供的基础研究证据。