低温嗜碱性纤维素降解细菌的分离与鉴定

孟建宇，丁雪敏

（内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究室，内蒙古呼和浩特010011）

经济和人口的快速增长使得环境污染及能源危机等问题日益显著，因而寻找这些问题的解决方法尤为重要。纤维素是自然界中最丰富的可再生资源之一 （林燕萍，2018；Patyshakuliyeva 等，2016），利用纤维素酶将自然界中的纤维素物质降解后可重新利用，其对于缓解能源危机及环境污染问题等有重大意义。中高温纤维素降解菌的降解活性在寒冷环境中有很大程度上的降低，而低温纤维素降解菌所产生的纤维素酶具有独特的适应机制，使反应在低温环境中仍然进行，无需加热和冷却等额外条件 （李春艳等，2015；王玢等,2003）。因此利用低温纤维素降解菌可达到生产成本低廉、节约能源的目的，从而使纤维素的降解在低温环境中呈现出极大的优势 （张丽珉等，2018；董硕等，2011；王世杰等，2011），故寻找高效的低温纤维素降解菌是目前研究的热点。

在降解纤维素的微生物中，真菌降解纤维素的能力较为突出，但因生长比较缓慢、不耐热、不耐碱性等限制了其工业化的发展 （ Ruijssenaars等，2004）。但细菌拥有来源广、种类多、生长快、适应极端环境能力强等特点，使工业化生产易实现，故显现出了巨大的应用前景，碱性纤维素酶耐碱性强、热稳定性好、发酵周期短（Li 等，2012），在废水处理、纺织、造纸和洗涤等行业有较高的应用价值。而国内外对碱性低温纤维素降解细菌的研究报道相对较少（李强等，2012）。

内蒙古西部地区土壤盐碱化较普遍，秋冬季节持续时间长且年平均气温偏低，是低温嗜碱性微生物生长的适宜环境。本研究在4 ℃条件下，对内蒙古西部地区土壤中具有降解纤维素能力的细菌进行筛选，以挖掘高效的低温纤维素嗜碱性纤维素降解菌，为解决环境污染及能源危机等问题提供一种可持续发展的生物措施。

1 材料与方法

1.1 样品 样品采自内蒙古西部地区盐碱地的表层土壤，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 培养基配方 富集培养基： 秸秆末 5 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 9.0。

分离培养基：CMC-Na 5 g，酵母提取物 2 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 9.0。

1.3 菌株的分离纯化 将采回的土样充分混合后加入以秸秆为唯一碳源的pH 为9 的富集培养液中，4 ℃下富集培养10 d，转接新鲜培养基再次富集，转接3 次。取10 mL 富集液加入含90 mL无菌水的三角瓶中，置于 120 r/min 摇床中振荡1 h，充分混匀，然后将富集后的样品溶液稀释成10-2～10-5稀释度的溶液，涂布于分离培养基，4 ℃培养10 d。挑取不同形态、颜色的单菌落进行纯化，获得纯培养物。

1.4 菌株的鉴定 对分离的菌株进行细菌DNA的提取（胡晓红等，2008）后，用细菌通用引物对27F 和1492R 进行PCR 扩增，扩增产物回收纯化后送上海生工测序公司测序。将测序的结果利用RDP 在线程序Classifier 及NCBI 数据库的Blast-n程序进行相似性比对分析。

1.5 酶活性测定 用DNS 法测定酶活性。在1 mL粗酶液中加入 2 mL 1%（W/V） 的 CMC-Na 缓冲液，于50 ℃恒温水浴锅中反应30 min，然后加入2.5 mL DNS 试剂，于沸水浴中煮沸5 min，冷却后定容25 mL，用酶标仪测定540 nm 下的吸光值。

酶活力定义： 在50 ℃的反应条件下，1 min 内催化底物生成1 μmoL 葡萄糖所需的酶量为1 IU/mL。

2 结果与分析

2.1 低温碱性纤维素降解细菌的分离筛选 以CMC-Na 为唯一碳源，从内蒙古西部地区偏碱性土壤样品中筛选嗜碱低温纤维素降解细菌，共获得5株具纤维素降解能力的菌株：X2（3）、X6-1、X4（1）、X7-1 和X3-1，其菌落形态特征如表1 所示。

表1 菌落形态特征

2.2 16 S rDNA 序列同源性分析 本研究采用细菌16S rDNA 通用引物对所提取的纯菌菌株X2（3）、X6-1、X4（1）、X7-1 和 X3-1 的 DNA 进行了16S rDNA PCR 扩增，扩增产物电泳结果见图1。由图可见，PCR 产物片段清晰且单一，均约为1.5 kb，与预期目的片段长度接近。

图1 16S rDNA PCR 电泳检测图

对测序所得序列，根据测序图谱峰型截取合适长度后，利用NCBI 数据库的Blast-n 程序对其进行16S rDNA 序列分析以确定菌株的种属关系。通过结合细菌形态特征和利用NCBI 数据库的Blast-n 程序对测序获得的部分长度16S rDNA序列（821 bp）进行了同源性分析（表2），结果表明菌株 X2（3）与 Paenibacillus 最同源，同源性达到99%，推测其为类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的一个种。菌株 X6-1 与 Sphingobacterium daejeonense 最同源，同源性达到100%，推测其为鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）的一个种。菌株X4（1）与Microbacterium 最同源，同源性达到 99%，推测其为微杆菌属（Microbacterium）的一个种。菌株 X3-1 与 Pseudomonas 最同源，同源性达到98%，推测其为假单胞菌属（Pseudomonas）的一个种。菌株 X7-1 经分析为 Uncultured bacterium clone，在Blast-n 分析中未找到同源菌。

表2 菌种鉴定和Blast-n 同源性分析结果

2.3 酶活测定 对分离得到的菌株进行酶活测定，相对酶活性为 24～29 IU/mL，菌株 X2（3）酶活最高，为28.60 IU/mL，菌株X7-1 酶活最低，为23.72 IU/mL（表3）。

表3 菌株酶活测定

3 讨论

目前纤维素酶产生菌的研究主要集中在真菌，且研究较多的是木霉属、曲霉属、真菌属等产生的酸性纤维素酶（刘森林等，2008），而对细菌降解纤维素的研究较少（崔秀秀等，2016；Brown 等，2014），尤其是可产生碱性纤维素酶的低温细菌。本文对内蒙古西部地区碱性土壤中的低温嗜碱性纤维素降解菌进行分离，最终得到五株具有较高酶活性的低温嗜碱性纤维素降解菌。通过16S rDNA 序列同源性分析显示菌株X2（3）属于类芽孢杆菌属（Paenibacillus），酶活性为 28.60 IU/mL；菌株 X6-1属于鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium），酶活性为24.65 U/mL；菌株 X4（1）属于微杆菌属（Microbacterium），酶活性为 26.02 IU/mL 菌；菌株 X3-1 属于假单胞菌属 （Pseudomonas），酶活性为 24.41 IU/mL；菌株X7-1 在Blast-n 中未找到其同源菌，推测可能为该菌株可能属于新的菌属，酶活性为23.72 IU/mL。得到的五株低温嗜碱性纤维素降解菌的酶活性均高于已报道文献的酶活性（何海燕等，2019；陈雅娟等，2014；迪丽拜尔·托乎提等，2013；刘森林等，2005）。今后可利用液体发酵进一步研究五株低温嗜碱性纤维素降解菌发酵的最适条件、发酵的最适底物、酶作用的最适条件等，为开发应用高效的低温纤维素嗜碱性纤维素降解菌奠定基础。