ICP-MS法测定柴胡注射液中18种重金属及有害元素*

2020-06-29王留留

中医研究 2020年8期

张丹，王留留，李凯

(1.郑州市食品药品检验所，河南郑州 450006； 2.河南中医药大学河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南郑州 450046)

柴胡注射液为北柴胡经水蒸气蒸馏后，加聚山梨酯80和氯化钠等制成的中药注射剂，具有清热解表的功效，用于治疗感冒、流行性感冒及疟疾等的发热[1]。柴胡注射液的疗效确切，临床应用至今已七十多年[2]。近年来，有关柴胡注射液的药品不良反应的报道不断增加，其中严重的不良反应为过敏性休克，可危及患者生命[3-9]。与其他制剂相比，中药注射剂不经消化吸收直接进入血液，风险较高，而重金属及有害元素是中药制剂毒副作用的来源之一[10-11]。因此，对中药注射剂的重金属及有害元素的检测和限量控制十分重要。《中国药典》(2015版)四部通则0102注射剂中重金属及有害元素残留量[12]4-6项下仅规定了Pb、Cd、As、Hg、Cu 5种元素的限量，而未对其他重金属元素残留量进行监控。本研究参考国际人用药物注册技术协调会议(ICH) Q3D(R1)[13]、《中国药典》(2015 版)四部通则9302[12]402-404，以及《美国药典》(USP)通则<232>[14]的相关要求，建立了电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法同时测定柴胡注射液中18种元素含量的检测方法，实现了多元素的同时测定，并拟定了本品中18种元素的限度。该方法操作简便，准确可靠，专属性强，灵敏度高，可对柴胡注射液中重金属及有害元素残留量进行监控，为其他中药注射剂中重金属及有害元素残留的检测提供了有益借鉴，为相关药品的风险监控提供了可靠依据。

1 药品、试剂与仪器

柴胡注射液，河南润弘药业有限公司产品，2 mL/支，批号1803252，1904211，1904281，1904282；辅仁药业集团有限公司产品，批号2003091，2003101，2003111；信合援生制药股份有限公司产品，批号1907091，1911011；河南福森药业有限公司产品，批号2001151。

Al、As、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、P、Pb、Pt、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn多元素标准溶液，国家有色金属及电子材料分析测试中心提供，100 mg/L，批号20D3095；银(Ag，批号19C046-3)、钪(Sc，批号184017)、锗(Ge，批号192037)、铟(In，批号191009)、铋(Bi，批号191016-2)、金(Au，批号19C003-2)单元素标准溶液，国家有色金属及电子材料分析测试中心提供，1 000 mg/L；Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U调谐液，德国Thermo Scientific公司产品，1.0 μg/L，批号7684；硝酸，优级纯，美国SIGMA-ALDRICH公司产品，批号STBG6502；水为纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司产品，批号20191003；ICAP-Q 电感耦合等离子体质谱仪,美国Thermo Fisher Scientific公司产品；Multiwave PRO微波消解仪，奥地利Anton Paar公司产品。

2 方法与结果

2.1 仪器参数

2.1.1 ICP-MS参数

等离子体功率1 550 W，冷却气流量14.0 L/min，辅助气流量0.80 L/min，碰撞气流量4.83 mL/min，雾化器流量1.06 L/min，雾化器压力2.47 bar，雾化室温度2.70 ℃，蠕动泵转速40 r/min，冷却水流量 0.68 L/min，矩管水平位置0.43 mm，矩管垂直位置 0.39 mm，采样深度5.0 mm，每点滞留时间0.02 s，数据采集模式为KED，数据采集方式为跳峰，重复次数为3次。

2.1.2 微波消解程序

见表1。

表1 微波消解程序

2.2 溶液制备

2.2.1 混合标准溶液制备

精密量取Al、As…… Zn多元素标准溶液和Ag单元素标准溶液适量，用体积分数20 mL/L的硝酸溶液稀释制成质量分数均为1 mg/L的混合标准储备溶液。临用时分别精密量取上述混合标准储备溶液适量，用20 mL/L硝酸溶液稀释制成质量分数分别为0.1,0.5,1,5,10,20,50 μg/L的系列混合标准溶液。

2.2.2 内标溶液制备

分别精密量取Sc、Ge、In和Bi单元素标准溶液适量，用体积分数20 mL/L 的硝酸溶液稀释制成质量分数均为500 μg/L的混合内标溶液。

2.2.3 Au元素标准溶液制备

精密量取Au单元素标准溶液适量，用体积分数20 mL/L 的硝酸溶液稀释制成质量分数为1 mg/L的溶液，即得。

2.2.4 供试品溶液制备

精密量取供试品0.5 mL，置耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸6 mL，密闭并按2.1.2项下的微波消解程序进行消解。消解完全后，消解液冷却至60 ℃以下，取出消解罐，在130 ℃赶酸至约1 mL，放冷，将消解液转入50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入Au单元素标准溶液(1 mg/L)200 μL，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 试剂空白溶液制备

除不加Au单元素标准溶液外，按2.2.4项下供试品溶液制备方法制备即可。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

取2.2.1项下系列混合标准溶液，按2.1.1项下方法测定，以内标元素校正过的各元素响应值为纵坐标(Y)，以相应的质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得到回归方程，结果见表2。结果表明，各元素在各自浓度范围内线性关系良好。

2.3.2 检出限及定量限

取2.2.5项下试剂空白溶液，按2.1.1项下方法连续测定11次，以其响应值的3倍的标准偏差除以相应元素标准曲线的斜率作为各元素的检出限(LOD)，以其响应值的10倍的标准偏差除以相应元素标准曲线的斜率作为各元素的定量限(LOQ)，结果见表2。

表2 待测元素线性关系、检出限、定量限和精密度

2.3.3 精密度试验

取2.2.1项下的混合标准溶液(10 μg/L)，按2.1.1项下条件重复测定6次，计算各元素的RSD。结果：Li、Al、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Mo、Ag、Cd、Sn、Sn、Ba、Hg、Pb的RSD分别为0.8%、2.6%、1.3%、0.8%、0.5%，5.7%、1.2%、0.9%、4.0%、1.3%、0.8%、1.5%、0.5%、0.6%、1.0%、1.5%、2.3%、1.2%。结果表明，仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

取同一批柴胡注射液(批号1904282)6份各0.5 mL，分别精密加入混合标准储备液0.5 mL，按2.2.4项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1.1项下条件分别测定。结果：Li、Al、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Mo、Ag、Cd、Sn、Sn、Ba、Hg、Pb的RSD分别为0.9%、2.1%、1.5%、1.1%、1.8%、3.3%、1.2%、1.8%、1.7%、2.4%、0.8%、1.6%、2.1%、0.4%、1.2%、0.5%、0.6%、1.1%。结果表明，该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验

精密量取同一批柴胡注射液(批号1904282)各0.5 mL，分别置耐压耐高温微波消解罐中，共9份，分为3组，每组3份平行样。分别精密加入混合标准储备液0.25，0.5，0.75 mL，按2.2.4项下方法制备加样供试品溶液，按2.1.1项下条件进样测定，计算回收率及其RSD。结果：Li、Al、Ti、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Mo、Ag、Cd、Sn、Sn、Ba、Hg、Pb的平均加样回收率分别为85.5%、89.8%、92.8%、85.7%、85.7%、89.8、82.1%、88.3%、112.8%、87.9%、100.7%、103.1%、91.6%、92.6%、88.1%、96.7%、101.2%、101.3%，RSD分别为1.6%、1.6%、3.0%、0.8%、1.2%、3.5%、1.0%、1.9%、2.3%、1.9%、0.9%、1.8%、1.2%、0.8%、1.2%、2.5%、3.2%、0.9%。结果表明，该方法准确度良好。

2.3.6 稳定性试验

取同一批柴胡注射液(批号1904282)，按2.2.4项下方法制备供试品溶液，在4 ℃条件下保存，分别在0，2，4，8，12，24 h，按2.1.1项下条件进样测定。结果：各元素的响应值的RSD分别为1.8%、3.0%、2.3%、1.8%、2.5%、2.1%、1.9%、2.2%、2.4%、2.8%、1.2%、2.0%、2.3%、0.7%、1.4%、0.7%、0.9%、1.7%。结果表明，该供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 供试品含量测定

取10批柴胡注射液，分别按照2.2.4项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下条件进样测定，通过回归方程计算含量，结果见表3。

表3 供试品含量测定结果 mg·L-1,n=3

3 讨论

3.1 供试品前处理方法

柴胡注射液中含有聚山梨酯80，黏度较大，基质较复杂，可能影响雾化和电离效率，进而影响测定准确性。在考察供试品前处理方法时，分别考察了直接稀释和微波消解两种方法。在加样回收率试验中，直接稀释法的回收率较低，可能是由于在进样时供试品微粒不能均匀地分散于载气中；微波消解法利用高压高温消解和微波快速加热，具有环境污染小、消解速度快、消解完全充分、回收率高的特点；因此，本试验采用微波消解法处理供试品。

微波消解后要进行加热赶酸，加热温度应低于130 ℃，因为经长期大量的实验发现，Hg元素在加热温度不超过130℃情况下回收率基本保持稳定；超过130 ℃时Hg元素会挥发，影响测定结果准确性。

在检测过程中，Hg易产生记忆效应，因为其具有极强的吸附性，容易吸附在样品瓶、泵管及矩管上。Hg可以溶解多种金属，与之形成汞齐，溶解度越大，形成的汞齐越稳定，越不易吸附在容器或管线表面；但溶解度过大，形成的汞齐在等离子体中难以分解离子化。因为Au在Hg中具有一定的溶解度，能够形成金汞齐，所以在供试品溶液中加入Au可消除Hg的记忆效应，提高结果的稳定性。

3.2 检测元素的选择及限量

《中国药典》2015版四部通则0102[6]注射剂项下重金属及有害元素残留量中规定了按各品种项下每日最大使用量计算，中药注射剂中Pb、Cd、As、Hg、Cu的残留量分别为不得超过12，3，6，2，150 μg。《中国药典》2015版四部通则9302中药有害残留物限量制定指导原则[14]规定，重金属及有害元素主要是指Pb、Hg、Cd、Cu、Ag、Bi、Ti、Sn、As等。《中国药典》2015版四部通则9304中药中Al、Cr、Fe、Ba元素测定指导原则[12]406-407，中药在种植、生产、加工等过程中可能会引入Al、Cr、Fe、Ba 等金属元素，其含量过高可能会带来潜在危害。柴胡注射液的元素杂质可能由原料饮片引入，因此，也应对制剂中的元素杂质进行监控。

国际人用药物注册技术协调会议(ICH)Q3D[13]基于元素毒性及在药品中出现的可能性，将元素分为3类。第一类：As、Cd、Hg和Pb。这些元素对人有毒，药品生产中不得使用或限制使用，所有给药途径的风险评估中都必须评价这4种元素。第二类：2A类包括Co、Ni、V。这些元素在制剂中出现的可能性较高，需要对所有潜在来源和给药途径进行风险评估。2B类包括Ag、Au、Ir、Os、Pd、Pt、Rh、Ru、Se、Tl，这些元素在自然界中稀少，在药品中出现的可能性较低。除非在原料药、赋形剂或药品的其他组分生产中有意添加，否则不需要对它们进行风险评估。第三类：Ba、Cr、Cu、Li、Mo、Sb、Sn。对于生产中非有意添加的这些元素，其中Li、Sb、Cu在注射和吸入给药时需进行风险评估；Ba、Cr、Mo、Sn仅需在吸入给药时进行评价。其中规定了按每日最大使用量计算，Co、Ni、V、Ag、Ba、Cr、Li、Mo、Sb、Sn的残留量分别为不得超过5，10，20，10，700，1 100，250，1 500，90，600 μg。

《美国药典》(USP)通则<232>[15]规定了24种金属元素杂质(Cd、Pb、As、Hg、Ir、Os、Pd、Pt、Rh、Ru、Cr、Mo、Ni、V和Cu)的每日允许接触限值(PDE)。其中铂族元素Ir、Os、Pd、Pt、Rh和Ru为催化剂元素。柴胡注射液及其原、辅料在生产过程中并无使用过金属催化剂，故无需对这几种催化剂元素进行风险评估。

因此，选择Pb、Cd、As、Hg、Cu、Co、Ni、V、Li、Sb、Ti、Sn、Al、Cr、Fe、Ba、Mo作为待测元素。柴胡口服液的每日最大使用量为8 mL，本品每毫升含Pb、Cd、As、Hg、Cu、Co、Ni、V、Li、Sb、Sn、Cr、Ba、Mo 分别不得超过1.5，0.375，0.75，0.25，18.75，0.625，2.5，1.25，31.25，75，11.25，137.5，87.5，1.25 μg 。10批供试品中上述元素含量均低于规定值。Al、Fe、Ti 3种元素没有相关规定，需要进一步研究和探索。

3.3 内标元素的选择

采用ICP-MS 法检测多元素时存在明显的基体效应。基体干扰主要表现在样品基体检测过程中对检测元素信号产生抑制或增强效应，产生短期或长期漂移。通过加入与待测元素物理性质、化学性质和质量数相近的内标元素，可以监测和校正信号的短期和长期漂移，提高仪器的稳定性，改善测定的精密度，消除基体干扰。根据内标同位素质量数与待测元素质量数相近的原则，本研究选取了Sc、Ge、In和Bi作为内标元素。