PNPLA3、Sort1基因多态性与酒精性肝病易感性的关系

李晓飞，张丽萍，郭永胜

（1.焦作市第三人民医院传染三科、河南 焦作 454000；2.焦作市人民医院手术室，河南 焦作 454000；3.焦作市山阳区疾控中心，河南 焦作 454000）

酒精性肝病属于临床常见的肝脏疾病,主要是长期大量饮酒引发,近年来酒精性肝病的发病率呈现升高的趋势,对患者的生理和心理产生严重的影响,目前临床按照患者病情与病程将酒精性肝病分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化与酒精性肝硬化,有学者认为本病的发生同肝脏脂肪代谢存在关系,目前对疾病发生机制方面研究较多[1]。有学者报道乙醇在摄入人体内90%以上通过肝脏进行代谢,而酒精代谢过程在不同人群中会表现出个体化的差异性,基因多态性的研究在临床越来越广泛,有研究发现patatin 样磷脂酶3(patatin likephospholipase domain containing 3，PNPLA3) 基因的非同义序列变异在人体肝脏脂肪变性中发挥了重要作用,该基因编码的一种跨膜蛋白被证明在肝细胞膜中显著表达；Sort1 则是脂质代谢调节基因，由Sort1 编码分拣蛋白是载脂蛋白B100 的受体,主要定位在高尔基体的细胞内蛋白,同人体的脂质代谢调节关系密切[2]。本研究通过观察PNPLA3、Sort1基因多态性同酒精性肝病易感性之间的关系，为临床寻找酒精性肝病发生的风险因素,以期为临床提供指导和依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2017 年 1 月至 2018 年 3 月于我院治疗的已确诊酒精性肝病患者110 例为病例组，同时选取长期大量饮酒但未被诊断酒精性肝病患者100 例为无肝病嗜酒组、健康自愿者200例为对照组，纳入标准：⑴诊断符合《酒精性肝病诊疗指南》中的标准；⑵病例组和无肝病嗜酒组饮酒嗜酒≥5 年，乙醇量：男性≥40g/d，女性≥20g/d；⑶对照组受试者不饮酒；⑷所有受试者知情同意。排除标准：⑴合并有HAV、HBV 等肝炎病毒感染、药物性肝病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等；⑵已行肝移植手术者。各组受试者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组一般资料比较

1.2 实验方法 抽取患者血液提取DNA，取100μl血液加入离心管,加入PBSSolution100μl 混匀,加入ProteinaseK20μl, 加入 Buffer CL200μl56℃水浴 10 min,加入污水乙醇混匀，置入收集管中放置2min后10000rpm 离心1min,吸附置入收集管,加入CW 1Solution500μl,离心 30s，弃掉废液后加入 CW2Solution500μl,离心 30s 弃掉废液,将收集管于 12000 rpm 室温离心 1min，离去 CW2 Solution，将吸附柱放入一个新的离心管加入CE Buffer 50μl，静置3min，室温离心2min 收集DNA 溶液。提取的DNA放于-20℃冰箱保存。全血基因组DNA 抽提试剂盒由生物工程(上海)股份有限公司提供。

PNPLA3 基因检测：进行PCR 扩增反应，应用琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行鉴定, 向干净烧瓶中加入50ml 5×TBE 溶液，随后加入450ml 蒸馏水,充分混勾制成0.5×TBE 溶液，将1g 琼脂糖加入烧瓶，将已经加好试剂的烧瓶放入微波炉中，高温加热2min 至烧瓶中液体沸腾，取出后待凝胶冷却到50℃左右加入Ultra Power 核酸染料摇晃混匀，静置3~5min。进行电泳反应, 加入制备好的0.5×TBE 溶液至电泳槽，加入5μl DNA Marker 及PCR产物和Loading Buffer 混合物，电压设置为1OOV，30min 后取出，拿至紫外灯下鉴定。

Sort1 基因检测：取规格为1.5mlEP 管中配置PCR master mix，PCR 引物由北京博淼生物科技有限公司提供，引物浓度为1μmol/L，保存于-20℃冰箱备用，在384 孔板的每个加样孔中加入4μl PCR master mix,加入 1μl 模板 DNA 进行混匀,进行 PCR扩增反应, 在10μlPCR 产物中加入5U SAP 酶和2U Exonuclease I 酶, 恒温水浴1h,75℃下灭活15 min, 连接反应后将连接产物稀释取0.5μl 同0.5μl Liz500 SIZE STANDARD 和 9μlHi-Di 混匀,变性后使用MALDI-TOF 质谱仪分析。

1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS19.0 软件，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；计数资料比较使用χ2检验；遗传平衡性检验采用Hardy-Weinberg 检验。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 PNPLA3、Sort1 基因多态性结果 PNPLA3 基因 rs738409 位点检测出CC、CG、GG 三种基因型，Sort1 基因 rs646776 位点检测出 CC、TC、TT 三种基因型，各组PNPLA3、Sort1 基因多态性分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。

2.2 各组PNPLA3、Sort1 基因多态性分布比较 病例组PNPLA3 基因GG 型和等位基因G 的比例分布明显高于无肝病嗜酒组和对照组 （χ2=28.445 和12.834,36.642 和 14.504，P＜0.05）,见表2;各组 Sort1基因多态性分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.3 病例组各PNPLA3、Sort1 基因型血脂水平比较病例组不同 PNPLA3 基因型患者 TG、TC、HDL-C和 LDL-C 比较差异无统计学意义（P＞0.05）；病例组 Sort1 基因 TT 型患者 TG 高于 CC+CT 型患者，而 HDL-C 低于 CC+CT 型患者（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

酒精性肝病属于临床常见的肝损伤类型之一,主要是由于长期酗酒导致，会带来社会不稳定、家庭矛盾等多种风险,酒精对于肝脏的损害在及时戒酒后一段时间内仍会继续进展,目前对于本病的发病机制研究尚不清楚，因此有效的治疗方法不多，主要以肝功能的保护为主[3,4]。目前认为酒精性肝病主要是遗传因素与环境因素共同作用结果,长时间大量酒精摄入、高脂肪高热量饮食均可能造成疾病发生, 近年来随着全基因组关联研究发现PNPLA3 基因和Sort1 基因均可能和多种疾病发生发展有关，但是传统的研究多数集中在肝癌、病毒性肝炎中，在酒精性肝病的研究报道较少[5]。有报道指出脂肪变性是酒精性肝损伤的早期阶段,通过脂质过氧化反应以及细胞因子激活会引发肝细胞的炎症反应，最终进展为纤维化[6,7]。近年来全基因组关联分析一直是重要的观察基因变化手段，通过测定特定物种不同个体间的基因来了解基因变化情况,对确定遗传和表型以及基因和疾病的关联性具有重要研究意义[8,9]。本研究拟在通过对PNPLA3基因和Sort1 基因多态性情况和酒精性肝病易感性之间关系，以期为临床提供一定的依据。

表2 各组PNPLA3 基因多态性分布

表3 各组Sort1 基因多态性分布比较

表4 病例组各PNPLA3、Sort1 基因型血脂水平比较

PNPLA3 为patatin 磷脂酶家族,编码基因在22号染色体长臂1 区3 带3 亚带1 次亚带,可以编码非分泌型蛋白, 这一蛋白由481 个氨基酸组成,具有非特异性酰基水解酶活性，具有高度水解序列，PNPLA3 活性中心丝氨酸就在此序列,和天冬氨酸进行结合,这个结合的二元体就是发挥催化作用的关键部位[10]。PNPLA3 在人类各组织中均有广泛表达，而肝脏和脂肪组织表达最多，尤其是发生变异后会造成肝细胞脂肪分解代谢变化,肝脏的脂肪堆积增多，促进脂肪肝的形成，而且还会降低甘油三酯在细胞间的运输动力,使得他们更容易受到脂质过氧化，进而导致氧化应激，对肝细胞造成损伤和炎症[11]；此外还可通过造成肝脏脂肪变性及肝细胞的炎症而对肝纤维化产生影响,肝细胞损伤和炎性介质的释放会导致库普佛细胞二次活化，放大炎性反应进而导致肝细胞死亡, 肝星状细胞活化,肝脏纤维程序激活[12]。有学者研究发现PNPLA3 的基因多态性同肝脏脂肪含量增多以及肝脏纤维化程度密切相关。Stickel F 等人研究德国两组人群rs738409 位点的多态性，发现该位点多态性可能通过介导肝脏脂质沉积引起酒精性肝病患者炎症反应的发生与进展,发现PNPLA3 rs738409 基因多态性与酒精性肝病的发生以及进展为肝硬化相关[13]。

分拣蛋白1（Sort1）属于一个新的脂质代谢调节基因，与低密度脂蛋白代谢相关，主要定位在跨高尔基体网状结构上,在溶酶体转运蛋白质的过程中起到了重要的作用，Sort1 基因主要包含在染色体1p13.3 上, 利用染色体基因图谱绘制的表达数量性状位点分析显示，Sort1 次要等位基因C 纯合子在肝脏中表达增高,但是次要等位基因纯合子在内脏脂肪中不表达, 说明了1p13.3 区域具有肝脏特异性[14]。加拿大学者研究发现，青少年人群中携带次要等位基因C 的纯合子能够降低青少年人群中甘油三酯与极低密度脂蛋白水平[15]。

本研究显示，PNPLA3 基因rs738409 位点检测出CC、CG、GG 三种基因型，Sort1 基因 rs646776 位点检测出CC、TC、TT 三种基因型，酒精性肝病患者PNPLA3 基因GG 型和等位基因G 的比例分布明显高于无肝病嗜酒组和对照组，说明PNPLA3基因GG 型和等位基因G 人群容易发生酒精性肝病。但是酒精性肝病的发生同Sort1 基因分布无相关性。但是在对酒精性肝病患者血脂水平同两种基因型分析发现，酒精性肝病患者不同PNPLA3基因型患者 TG、TC、HDL-C 和 LDL-C 无差异，但是 Sort1 基因 TT 型患者 TG 高于 CC+CT 型患者,而 HDL-C 低于 CC+CT 型患者，说明 TG、HDL-C表达水平或可用于提示酒精性肝病Sort1 基因TT型。本研究优势在于从基因学层面分析了PNPLA3基因、Sort1 基因同酒精性肝病的发生之间关系,开展了初步研究,提供了酒精性肝病遗传学研究的相关证据,有希望从该基因关键分子入手发现更为敏感的、可信的生物学指标用于预测酒精性肝病的发病风险，并从遗传学角度阐明酒精性肝病发生、发展的机制,为进一步的针对该基因靶向治疗提供理论依据。

综上所述，PNPLA3 基因多态性与酒精性肝病易感性有一定关系，Sort1 基因多态性与酒精性肝病易感性无明显关系，但与患者血脂水平相关。