剥脱型青光眼LOXL1基因多态性分析

兰兰，雷方

（1.河南科技大学第一附属医院眼科，河南 洛阳 471003；2.河南科技大学，河南 洛阳 471000）

剥脱综合征(exfoliation syndrome，XFS)最早由Linberg 于1917 年提出,主要症状是眼前段灰白色纤维状或头皮屑状剥脱,沉积于瞳孔边缘、虹膜表面、晶状体表面和悬韧带、前房[1]。剥脱物质被认为是由涉及系统结缔组织的异常细胞外基质引起的疾病,并且与老年细胞中异常代谢过程有关[2]。这种特征性组织变化可引起广泛的眼内并发症,包括青光眼、色素分散、晶状体半脱位、瞳孔扩张、眼部房水屏障功能受损、虹膜后粘连和角膜内皮退化[3]。青光眼是导致眼睛失明的原因之一,是一种以视神经抑制和视野缺陷为特征的疾病,眼压的病理性增加是青光眼性视神经病变的主要危险因素,由视神经乳头充盈不足和缺血引起的眼内微循环障碍是另一种致病因素[4]。本次研究选取2016 年1 月至2019 年2 月在我院治疗的剥脱型青光眼患者91例，探讨类赖氨酸氧化酶1（LOXL1）基因多态性与剥脱型青光眼发病的关系，研究报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2016 年 1 月至 2019 年 2 月在我院治疗的剥脱型青光眼患者91 例作为观察组,纳入标准：⑴诊断符合《眼科学》中的标准；⑵汉族人群；⑶患者及家属知情同意。排除标准：⑴有眼部手术史；⑵合并有糖尿病、肝肾功能异常、恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫系统疾病等。同时选取180 例健康志愿者作为对照组 （无青光眼等眼部疾病家族史），观察组和对照组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 观察组和对照组一般资料比较

1.2 检测方法 两组患者从常规肘静脉抽取5ml空腹静脉血，并用乙二胺四乙酸钠进行抗凝，并储存在-80℃的冰箱中。通过苯酚抽提法提取DNA，并使用PCR 法和限制性片段长度多态性技术检测LOXL1 基因多态性的特征[7]。通过紫外分光光度计ND1000 测量 DNA 浓度和纯度。光密度 （A）值(260nm/280nm)在 1.8 和 2.0 之间，并且 DNA 纯度被认为是可接受的。工作浓度为100μg/ L，样品在20℃下储存在冰箱中,备用样品储存在80℃的冰箱中，以降低多个冻融样品降解的可能性。指定特定位 点 的 引 物 ：rs2165241 (F：5'-CTCTAGGGCCCCTTGGAGAAT-3' 和 R：5'-GGCCAGAGGTCTGCTAAGCAC-3'),rs1048661 和 rs3825942(F：5'.ATTC GGClTITGGCCAGGT-3' 和 R：5'-GAACTGCTGCG GGTAGGA-3'[5])。

PCR 法 ：4μl100mg 基 因 组 DNA，20μlPCRMasterMix，1μl(10nmol/L)上游和下游引物，14μlddH20。PCR 反应条件：rs2165241：在 94℃预变性5min, 在 94℃变性 30s, 在 65~60℃退火 1min,在72℃延伸 45s,10 个循环;在 94℃变性 30s,在 60 ℃退火 1min,45℃在 72℃延伸，30 个循环后，72℃再延 长 1min，PCR 产 物 为 321bp。Rsl048661 和rs3825942：在 94℃预变性 5min 后, 在 94℃变性30s，在 58~55℃退火 30s，在 72℃延伸 45s，6 个循环;在 94℃变性 30s,在 55℃退火 30s，在 72℃延伸45°S,29 个循环后,在 72℃进一步延伸 5min,PCR 产物为200 bp。将5μlPCR 产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。

1.3 统计学处理 数据分析统计采用SPSS22.0 软件，年龄采用均数±标准差表示，组间比较使用t 检验，计数资料比较使用卡方检验，样本代表性采用Hardy-WeinBerg 遗传平衡检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 LOXL1 基因三位点多态性情况 LOXL1 基因rs2165241 位点基因型包括 TT、CT 和 CC，rs1048 661 位点基因型包括 GG、GT 和 TT，rs3825942 位点基因型包括 GG、GA 和 AA；观察组合对照组LOXL1 基因 rs2165241、rs1048661 和 rs3825942 位点基因型分布符合Hardy-WeinBerg 遗传平衡定律（P＞0.05），样本有群体代表性。

2.2 两组LOXL1 基因rs2165241 位点基因型及等位基因分布比较 观察组和对照组LOXL1 基因rs2165241 位点基因型及等位基因分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 两组LOXL1 基因rs3825942 位点基因型及等位基因分布比较 观察组和对照组LOXL1 基因rs3825942 位点基因型及等位基因分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 两组LOXL1 基因rs1048661 位点基因型及等位基因分布比较 观察组LOXL1 基因rs1048661位点基因型GG 及等位基因G 比例明显高于对照组，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

3 讨论

青光眼是由多种危险因素诱发的视神经变性疾病。青光眼患者的视觉损伤的发病机理是由视网膜神经节细胞的细胞凋亡导致眼内压升高和低灌注诱导的缺血导致视网膜微循环障碍,从而破坏缺血条件下的血管,产生和平衡抗血管生成因子[4]。流行病学研究表明，XFS 发生在世界上所有地理区域，老年人和青光眼患者的发病率更高，在白种人中更为常见,但患病率不同并且随着年龄的增长而增加，可以影响到世界范围10%~20%的60 岁以上人群[6]。原发性青光眼分为闭角型和开角型，不同区域患者比例不同。中国原发性闭角型青光眼与原发性开角型青光眼的比例为3.7：1, 新加坡为4.5：1，日本为 1：7.7，欧美国家为 1：5.7[7]。TGFβ 信号通路在人小梁网细胞中诱导LOX 基因的表达，提示该基因可能影响由眼压和房水流出阻力引起的青光眼[8]。

表2 两组LOXL1 基因rs2165241 位点基因型及等位基因分布比较

表3 两组LOXL1 基因rs3825942 位点基因型及等位基因分布比较

表4 两组LOXL1 基因rs1048661 位点基因型及等位基因分布比较

LOXL1 是赖氨酸氧化酶家族的成员。赖氨酸氧化酶是含铜的细胞外酶,编码的蛋白质具有多种生物学功能,其功能是通过赖氨酸氧化脱乙酰化或赖氨酸的羟基侧链式作用催化胶原蛋白和弹性蛋白在结缔组织中的共价交联,其产物是弹性纤维系统形成的关键酶[8]，家族包括五个特殊成员：赖氨酸氧化酶（LOX）和赖氨酸氧化酶样1-4（LOXL1，LOXL2，LOXL3 和 LOXL4）[9]。LOXL1 是细胞外基质代谢中的关键交联酶，位于15q22，编码赖氨酸氧化家族的成员,其在交联的胶原蛋白和弹性蛋白中形成，在弹性纤维的形成，维持和重塑中起重要作用[10]。通过对子宫内膜异位症中LOXL1 基因表达的研究，LOXL1 可能参与子宫内膜异位症的病理生理过程, 这与盆腔器官组织脱垂的程度有关[11]。Thorleifsson[12]等人通过研究剥脱性青光眼LO XL1 的常见序列变异, 发现LOXL1 与剥脱性青光眼之间存在显着相关性。

2007 年，Thorleifsson 等[13]报道了 LOXL1 基因中的3 个单核苷酸多态性（SNPs）位点,而rs2165 241，rs3825942 和 rs104866l 与剥脱性青光眼有很强的相关性。许多研究证实，LOXL1 基因等位基因频率，基因型，基因单倍型和复杂基因型在不同人群中存在差异，LOXL1 基因多态性是导致剥脱性青光眼遗传易感性的一个因素[14-16]。本次研究结果显示LOXL1 基因rs2165241 位点基因型包括TT、CT 和 CC，rs1048661 位点基因型包括 GG、GT 和TT，rs3825942 位点基因型包括 GG、GA 和 AA；观察组合对照组 LOXL1 基因 rs2165241、rs1048661和rs3825942 位点基因型分布符合Hardy-Wein-Berg 遗传平衡定律（P＞0.05），样本有群体代表性。两组LOXL1 基因位点基因型及等位基因分布比较，观察组和对照组LOXL1 基因rs2165241 位点和rs3825942weid 基因型及等位基因分布比较差异均无统计学意义，观察组LOXL1 基因rs1048661位点基因型GG 及等位基因G 比例分别为62.64%和80.22%，明显高于对照组，差异比较有统计学意义。显示与XFS 患者的遗传易感性相关，并且每个多态性位点具有较强的相关性，rs2165241 位点的基因型TT 是危险的基因型，等位基因T 是危险的等位基因，即相同区域内全血DNA 分析rs2165241位点TT 基因型和T 等位基因的发生与XFS 呈正相关。Rsl048661 位点的等位基因G 是一个危险的等位基因，即同一区域群体的全血DNA 检测分析与rsl048661 位点的G 等位基因中XFS 的发生呈正相关。Rs3825942 位点的等位基因G 是一个危险的等位基因，即同一区域群体的全血DNA 检测分析与rs3825942 位点G 等位基因中XFS 的发生呈正相关[17]。

综上所述，LOXL1 基因rs1048661 位点多态性与剥脱型青光眼发病可能有一定关系，LOXLl 基因可能是剥脱性青光眼的主要遗传危险因素，值得进一步研究。