辐射敏感基因Pig-a、Gadd45 α 和Hprt 作 为潜在生物剂量计的实验研究

杨学琴 毛鑫玉 陈钰婷 李悦兰 张 文

1（深圳市职业病防治院病理毒理所 深圳518020）

2（河北北方学院医学检验学院卫生检验与检疫专业 张家口075000）

随着人类基因组计划的推进，研究环境对人类健康影响的环境毒理学进入了毒理基因组学时代，从传统的遗传毒性检测方法转变为基因集群检测方法，同时提高遗传损伤效应的检测能力并降低检测阈值［1］。电离辐射是环境物理因素对人类健康影响的研究热点，对生物体的影响最为突出的分子机制表现为遗传物质的损伤。目前较为成熟的辐射遗传损伤检测主要有染色体畸变率分析和淋巴细胞微核分析。染色体畸变率分析是目前公认准确性高、较为可靠的“金标准”，实际应用中存在培养时间长，对镜检人员技术要求较高，耗时耗力等不足之处［2-3］。淋巴细胞微核分析的敏感性、特异性、准确性与染色体畸变率分析的结果几乎相当，是染色体损伤快速初筛的试验方法，但也需要对细胞进行培养，并且微核率易受年龄，生活方式和环境的影响，导致本底值升高［4］。随着毒理基因组学的不断发展，利用辐射敏感基因的集群检测方法估算电离辐射对人类健康的影响将会有效提高检测效率和敏感性。

利用生物学指标确定已接受照射剂量的测定体系称为生物剂量计，一个好的生物剂量计应具备以下几点［5］：对电离辐射有特异性或至少在正常人自发本底值较低；具有较高的灵敏度，且与照射剂量相关性较好；为整体与离体效应一致；对大剂量急性照射和对小剂量累积照射均有较好的剂量–效应关系；个体间变异小；方法简便，取材方便；测定方法快速，有可能借助仪器实现自动化。

传统的染色体畸变率分析和淋巴细胞微核分析两种方法对早期、快速、高效估算疑似受照人员剂量存在着方法本身的缺陷。本研究将从健康人群辐射敏感基因本底水平，健康人群与辐射接触人群辐射敏感基因表达量的差异性，以及辐射敏感基因的剂量–效应关系3个方面进行探索。选择 磷 脂 酰 肌 醇 聚 糖 -A 基 因（Phosphatidylinositolglycan-class A， Pig-a）、生长阻滞和DNA 损伤诱导基因45（Growth arrest and DNA damage inducible 45， Gadd45α）及次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase， Hprt）3 个基因，以人体外周血为材料，利用实时荧光定量PCR检测这3个基因的表达水平，对其是否能作为辐射损伤生物剂量计进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 外周血的采集与照射

选择非放射从业健康人群（对照组）和放射从业人员（暴露组）各25名，收集其体检血液2 mL，肝素钠抗凝。研究对象符合中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会制定的《涉及人的生物医学研究伦理审查办法（试行）》（2007）的要求，并通过深圳市职业病防治院伦理审查委员会讨论批准。严格按照批准的研究方案开展研究工作。

采集三名健康成年人（均无吸烟史与饮酒史，近期未接受X射线检查等放射影响）外周血各25 mL，肝素钠抗凝。将每份抗凝血平均分为5份，每份5 mL。照射条件：采用6 MV X射线机（Elekta Synergy，Linacd House， Fleming Way， Cawley， West Sussex PH10 2RR，UK），照射剂量率300 cGy/min，源靶距100 cm，照射野8.0 cm×8.0 cm。设置剂量为0Gy、0.10Gy、0.25Gy、0.50Gy、1.00Gy、2.00 Gy和5.00 Gy。 国际协调委员会（International Conference on Harmonization，ICH）颁布的指导原则S2（R1）受照细胞相对存活率不低于（55±5）%，每个剂量点至少重复3次［6］。将照射后的血样置于37 ℃的培养箱中放置6 h后进行mRNA的提取。

1.1.2 主要试剂和仪器

Red Cell Lysis Buffer（RT122-02）、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 反转录试剂盒（KR118）、FastFire qPCR PreMix （SYBR Green）快速荧光定量PCR预混试剂盒（FP207-01）（北京TIANGEN 公司）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 血 液 总 RNA 提 取 试 剂 盒（11828665001）（瑞士Roche 公司）；Optical 8-Cap Strips for 0.2 mL tube strips/plates（TCS0803）（美国Bio-Rad 公司）；Agarose， LMP， Preparative Grade for Large Fragments （＞1 000 bp）（V2831）（美国Promega 公司），Real Time PCR 仪（CFXConnect Bio-Rad 美国）。

1.1.3 基因引物

使用Olige 6 设计合成的引物序列见表1。正、反向引物序列为5′-3′。

表1 辐射敏感基因和内参基因引物序列Table 1 Primer sequence of radiosensitive gene and internal reference gene

1.2 方法

1.2.1 全血总RNA 的提取

将采集外周血500 μL 加入1.5 mL RNase-free EP管中，然后加入1 mL红细胞裂解液，倒置混匀10 min，使血样充分裂解，4 000 r/min 离心3 min，弃去上清液，加入200 μL PBS 缓冲液重悬。加入400 μL Lysis-/Binding Buffer，涡旋15 s。将样品沿管壁缓慢移至组合好的反应管上层，8 000 r/min离心15 s。弃去收集管废液后重新组合过滤篮，每管加入混匀的90 μL DNase Incubaton Buffer、10 μL Dnase I，孵育15 min。加入500 μL Wash Buffer I，8 000 r/min 离心15 s。弃废液后重新组合过滤篮，加入500 μL Wash Buffer Ⅱ，8 000 r/min 离心15 s。弃废液后重新组合过滤篮，加入200 μL Wash Buffer Ⅱ，11 000 r/min 离心2 min。弃去收集管，将过滤篮插入1.5 mL RNase-free EP管中，加入75 μL Elution Buffer，13 000 r/min 离心1 min。将收集到的总RNA放入-20°C保存。

1.2.2 总RNA反转录为cDNA

将-20 °C 保存的总RNA 取出，于冰上解冻。在冰上按照如下反应体系配制所需反应液的混合液：4 μL 的5×FastKing-RT SuperMix 和16 μL 的Total RNA；反应条件：42°C，15 min；95°C，3 min。将所得cDNA放入-20°C保存。

1.2.3 利用RT-PCR检测基因表达

将-20°C保存的cDNA取出，于冰上解冻。为了保证体系反应液配制的准确性，应按照多于1个反应数的进行试剂配制，然后分装到各个反应管中，最后加入cDNA 样品。反应体系20 μL，设置3个检测复孔。在冰上按照如下反应体系配制所需反 应 液 的 混 合 液：10 μL 的2×FastFire qPCR PreMix，正向引物（5 μmol/L）、反向引物（5 μmol/L）各1.2 μL，5 μL 的cDNA 模板，2.6 μL RNase-Free ddH2O，共20 μL 反应体系；反应条件：95 ℃1 min后进行40 个95 ℃5 s、55 ℃10 s、72 ℃15 s 的循环。用紫外分光光度计检测DNA 浓度和纯度（激发波长分别为260 nm 和280 nm 时吸光度的比值，A260/A280值）。

1.2.4 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行分析。辐射敏感基因本底水平统计分析采用平均值、波动范围（25%～75%）和变异系数（标准偏差/平均数）描述本底水平在人群中差异程度。健康人群与辐射接触人群敏感基因表达量差异性分析采用ΔCT（Threshold cycle，CT）方法，以看家基因Gapdh为内参，配对t检验分析两组统计学差异。辐射敏感基因剂量–效应研究利用2-△△CT法，计算各个敏感基因相对于内参基因的表达水平，ΔCT=CT，目的基因-CT，内参基因，ΔΔCT=ΔCT，照射组样品-ΔCT，对照组样品。RT-PCR检测结果数据采用单因素方差分析，二项式曲线回归分析，p＜0.05 为差异有统计学意义。采用Graphpad 5.0软件作图。

2 结果

2.1 人群样本基本信息

对照组和暴露组均为25 人。暴露组平均年龄为36.12岁，其中男性为19人，女性为6人，平均暴露时间为111.52 d；对照组平均年龄为23.76岁，其中男性为18 人，女性为7人，平均暴露时间为0 d。对照组和暴露组匹配。

2.2 SYBR Green 荧光定量RT-PCR 扩增特异性验证

熔解曲线分析显示Gapdh、Gadd45α、Hprt、Pig-a 基因均为单峰，并且Pig-a 基因PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳也显示为单一条带，表明PCR扩增均为特异性的扩增，见图1。

图1 Gapdh(a)、Gadd45α(b)、Hprt(c)与Pig-a(d)基因熔解曲线分析Fig.1 Analysis of Gapdh(a),Gadd45α(b),Hprt(c),and Pig-a(d)melting curves

2.3 辐射敏感基因本底水平统计分析

采集25 名非放射从业健康人员的外周血进行辐射敏感基因本底水平分析。Pig-a 基因相对表达量的平均值为2.990，波动范围是2.595～3.882，变异系数18.73%；Gadd45α 基因相对表达量的平均值为6.470，波动范围是2.693～8.627，变异系数19.62%；Hprt 基因相对表达量的平均值为6.470，波动范围是4.894～8.627，变异系数24.49%。Piga、Gadd45α 基因的变异系数均在20%以内，表明Pig-a、Gadd45α 基因在健康人群中本底水平差异较小，表达水平相对均一。Hprt 基因变异系数大于20%，表明在健康人群中本底水平差异较大，应考虑剔除。

2.4 暴露组和对照组敏感基因相对表达量的比较

Gadd45α、Hprt、Pig-a 基因相对表达量见图2。对照组与暴露组相比，差异均有统计学意义。Hprt基因在对照组中的相对表达量高于暴露组（t=2.105，p=0.046）；Gadd45α基因在对照组中相对表达量低于暴露组（t=4.762，p＜0.01）；Pig-a基因在对照组的相对表达量低于暴露组（t=2.441，p=0.022）。

图2 对照组与暴露组中Gadd45α(a)、Hprt(b)与Pig-a(c)基因相对表达量（***p＜0.01，**p＜0.02，*p＜0.05，与对照组相比）Fig.2 Gene expression of Gadd45α(a)、Hprt(b)、Pig-a(c)in control and exposed groups(***p＜0.01,**p＜0.02,and*p＜0.05 compared with the control group)

2.5 X射线照射后Gadd45α、Hprt、Pig-a基因表达的剂量-效应关系

如图3 所示，X 射线照射6 h 后，人外周血淋巴细胞Gadd45α 基因表达随着照射剂量的增加而上升，剂量和基因相对表达量拟合的二项式曲线为y=0.130 7x2+0.487 8x+1.251 8，相关系数为R2=0.989 7，曲线显示在0.5 Gy时，Gadd45α基因表达上升幅度较大；Hprt 基因相对表达量在0～2 Gy 范围内随着剂量的增加而上升，拟合曲线为y=0.577 2x2‒0.175 4x+1.014 7，R2=0.975 1，在5 Gy 剂量点表达量下降；Pig-a 基因表达随着照射剂量的增加而上升，y=0.363 5x2+0.176 4x+1.383 2，R2=0.995 8。经SPSS 19.0 回归分析检验，存在剂量-效应关系。

图3 辐射敏感基因Gadd45α(a)、Hprt(b)与Pig-a(c)剂量‒效应曲线拟合Fig.3 Dose‒effect curves for radiation sensitive genes Gadd45α(a),Hprt(b),and Pig-a(c)

3 讨论

核安全及辐射防护一直是环境保护与公共卫生关注重点的领域之一。核事故发生后的早期，对疑似受照人员进行受照剂量快速估算和分类诊断以及及时救治具有十分重要的意义。利用辐射敏感基因表达变化作为辐射损伤标志物用于生物剂量估算的研究早已有报道［7-9］。将特定的基因图谱改变与特定剂量或时间的毒性损伤表现相关联［10］。这些辐射敏感基因涉及DNA修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞骨架组装、信号转导等相关基因，并不局限于染色体损伤相关基因。这些敏感基因的改变包括表达量的变化和基因本身突变两种。

Pig-a 基因位于人类X 染色体短臂Xp22.1，可编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶复合物，参与糖基磷脂酰肌醇（GlycosyIphosphatidyl jnositol，GPI）连接蛋白的早期合成［11］。近年来Pig-a基因多用于Pig-a 突变试验，这是一种反映体内基因突变遗传学终点的致突变试验。Pig-a 基因的表达具有普遍性，目前多采用流式细胞仪检测外周血红细胞及淋巴细胞系的Pig-a 基因突变［12-13］。但实时荧光定量PCR 不仅方法操作简单，并且能快速明了地对结果进行分析，本次研究RT-qPCR的结果显示Piga基因表达量随着吸收剂量的增大而增加，具有一定的辐射敏感性，Pig-a 基因在健康人群的表达相对均一，波动范围较小，个体间变异小；辐射接触人群Pig-a基因的表达量高于健康人群，显示出小剂量长期照射对Pig-a基因表达的影响是刺激基因的表达；经X 射线照射后，发现Pig-a 基因的表达量随着照射剂量的增加而上升，具有很好的剂量‒效应关系。Pig-a基因在辐射接触人群中表现出的表达量增加和X 射线急性照射后表达量变化趋势相同，大剂量急性照射和小剂量累积照射均刺激Pig-a基因的表达。以上结果均显示出Pig-a基因相对表达量的变化有可能作为生物剂量计，具有好的生物剂量的特点，相较于传统的染色体畸变率分析和淋巴细胞微核分析，Pig-a 基因相对表达量检测时间大大缩短，从采样到RNA提取再到RTqPCR只需花费约2 h。

Gadd45α 基因是生长抑制DNA 损伤基因45 家族成员之一，为生长阻滞和DNA 损伤基因。该基因可被多种电离辐射诱导，以p53依赖和非依赖的方式表达增强，参与了细胞的生长抑制和DNA 的损伤诱导，在辐射诱导的细胞凋亡、细胞周期阻滞及DNA修复中起重要作用［14］。使用Cs γ射线照射大鼠外周血，Gadd45α基因表达量与照射剂量有关，基因表达量随照射剂量的增加具有一定的上升趋势［15］。潘艳等［16］在实验中使用实时荧光定量PCR检测60Co γ射线照射后正常人外周血永生化淋巴细胞系，结果表明：Gadd45 基因的表达水平随照射剂量的增高而增加。本次研究中验证了Gadd45α基因的辐射敏感性，Gadd45α基因在健康人群中的表达量相对均一，波动范围较小，个体间变异小；辐射接触人群的Gadd45α 基因表达量高于健康人群，具有较高的灵敏度，同时显示小剂量长期照射对Gadd45α 基因的表达影响是刺激基因的表达；经X射线照射后，Gadd45α基因的表达量随照射剂量的增加而上升，具有良好的剂量‒效应关系，与小剂量长期照射后Gadd45α 基因的表达趋势相同。以上结果均显示出Gadd45α 基因相对表达量的变化可能作为生物剂量计。

Hprt基因位于X染色体长臂远端q26.27，功能上是半合子，突变时可表现出来，由这个基因编码的蛋白质是一个转移酶。该基因对电离辐射以及化学诱变剂非常敏感，并且这种突变不可逆［17］。使用不同剂量的60Co γ 射线照射人肺泡细胞后，Hprt基因突变变异子数随剂量的增加而逐渐增加，回归方程表明两者呈良好的线性直线关系［18］。崔凤梅等［19］的实验结果中表明Hprt基因突变频率与照射剂量的关系呈线性模型，随照射剂量的增大，基因突变频率上升。在本次研究中表明Hprt 基因的辐射敏感性，Hprt 基因在健康人群中的表达量个体间变异较大；辐射接触人群的Hprt 基因表达量低于健康人群，具有较高的灵敏度，同时显示小剂量长期照射对Gadd45α 基因的表达影响是抑制基因的表达；经X 射线照射后，发现Hprt 基因的表达量在0～2 Gy 随照射剂量的增加而上升，具有良好的剂量‒效应关系，但在5 Gy剂量点表达量下降，偏离剂量‒效应曲线，与小剂量长期照射后Hprt 基因的表达趋势不同。以上结果显示出Hprt基因相对表达量的变化是否能作为生物剂量计体系有待进一步研究。

Pig-a基因与Gadd45α基因均具有本底值较低，差异较小，个体间变异小，对电离辐射有较高的灵敏度，基因表达量与照射剂量在大剂量与小剂量照射累积均具有良好的剂量‒效应关系等优点，说明Pig-a 基因与Gadd45α 基因有发展为良好的生

物剂量计的潜质。但Gadd45α 基因表达量在小剂量范围内存在波动，人群本底值大于Pig-a 基因，波动范围较Pig-a基因大，所以Pig-a基因可能更具有作为良好生物剂量计的潜质。本研究目前样本量偏少，结果可能存在一些不确定性，下一步对Piga基因表达和辐射之间的关系做进一步研究时，将扩大样本量，并增加照射后的采样时间点。而Hprt 基因本底值虽然较低但个体间变异较大，并且在5 Gy 剂量点偏离0～2 Gy 的剂量‒效应曲线，故其是否能成为一个生物剂量计还有待研究。