miRNA-200a调控淋巴瘤细胞增殖迁移的机制

农卫霞 王奎 张蕾 王新华 龙珍珠玛

(石河子大学医学院 1第一附属医院血液风湿科，新疆 石河子 832008；2预防医学系；3第一附属医院检验科；4石河子市人民医院病理科)

淋巴瘤是免疫系统的实体瘤。在病理学分类上，霍奇金淋巴瘤约占所有淋巴瘤的10%，其余90%被称为非霍奇金淋巴瘤〔1〕。淋巴瘤患者的组织学表现和临床特征具有异质性，其诊断和治疗比较困难，因此寻找新的治疗靶点用于鉴别诊断、制定治疗方案和评估预后等具有重要意义。微小RNAs(miRNAs)是一类高度保守的短链非编码RNA，通过与mRNA末端非翻译区特异性的结合从而进行转录后调控。miRNAs的异常表达对于肿瘤的形成有着重要的作用。miRNA-200a来源于miRNA-200家族中，已有研究表明其参与肝癌、乳腺癌和子宫内膜癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡等过程〔2～4〕。目前已有许多miRNAs与淋巴瘤的发生发展密切相关，但miRNA-200a与淋巴瘤的联系并不清楚。磷酸酶和张力蛋白同源(PTEN)基因作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色体10q23.3区，其编码的蛋白具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。当PTEN表达发生变化可改变对细胞生长的负性调控，导致细胞生长异常，导致肿瘤的发生。目前已知多种肿瘤中发现存在PTEN基因的突变，如前列腺、乳腺癌和淋巴瘤等〔5,6〕。本文在弥漫大细胞B淋巴瘤细胞系DOHH-2中干扰miRNA-200a的表达，观察细胞增殖与迁移能力的改变，并探讨其分子机制，为淋巴瘤的临床治疗提高新的靶标。

1 资料与方法

1.1材料 DMME培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；TRIzol试剂、逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度、Lipofectamine 2000测定试剂盒均购自美国赛默飞公司；CCK-8试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司)；双荧光素酶检测试剂盒(苏州宇恒生物科技有限公司)；鼠抗人miRNA-200a、PTEN单抗及辣根过氧化物酶(HRP)二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化SP900染色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)；MiniAmp PCR仪(美国ABI公司)；DYCZ-24KF电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.2细胞培养 DOHH-2细胞(上海素尔生物科技有限公司)，采用含有10%胎牛血清及1%青霉素的DMEM培养液培养，置于在37℃、95%相对湿度、5%CO2培养箱，隔天更换培养液，细胞融合度约为80%则进行传代培养。

1.3细胞转染 将对数期细胞种植于12孔板，每孔细胞密度为1×106个1细胞，分为3组：对照组细胞正常培养，阴性对照组及miRNA-200a转染组根据Lipofectamine 2000说明书转染。

1.4qRT-PCR检测miRNA-200a和PTEN mRNA表达 DOHH-2细胞进行转染的24 h后，采用qRT-PCR法检测miRNA-200a和PTEN的相对表达量。根据材料miRNA-200a特异性引物、内参材料U6引物及其他相应的引物组分可匹配成20 μl的联合反应引物体系(反应混合物10 μl、上下游引物各0.8 μl，DNA(每模板2 μl,ddH2O 6.4 μl)，以95℃ 5 min(1个连续循环)、95℃ 30 s(35个连续循环)、58℃ 30 s(35个连续循环)、72℃ 2 min(35个连续循环)和72℃ 6 min(1个连续循环)的综合反应量为条件分别进行了PCR的扩增。以β-肌动蛋白(actin)为基础内参。应用2-△△Ct法则可计算义为miRNA-200a的相对函数表达式向量。每组重复6次。miRNA-200a和PTEN的引物见表1。

1.5免疫印迹试验检测miRNA-200a和PTEN蛋白表达 DOHH-2细胞进行转染的24 h后，总细胞蛋白质使用BCA蛋白质测定法测量。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质样品并转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶在PBST中封闭1 h。在4℃下与miRNA-200a(1∶1 000)及PTEN(1∶500)抗体温育过夜，将聚偏氟乙烯膜用含TBST的缓冲盐水洗涤，与HRP缀合的山羊抗兔或马抗小鼠二抗在室温下孵育2 h，使用化学发光使蛋白带可视化，β-actin为内参。每组重复6次。

表1 引物序列

1.6CCK8检测DOHH-2细胞增殖 将DOHH-2细胞进行转染的24 h后，每孔中加入10%的CCK8溶液，孵育2 h，酶标仪检测490 nm细胞处的光密度的数值，计算DOHH-2细胞的存活率。每组重复6次。

1.7划痕实验检测DOHH-2细胞迁移 将DOHH-2细胞进行转染的24 h后，将各组细胞调整至相同的浓度接种于12孔板，待贴壁细胞出现贴壁悬浮后头迅速进行清理划痕，用PBS迅速洗去贴壁悬浮得来的细胞，并重新加入RPMI1640培养基。在显微镜下记录不同时间点下DOHH-2细胞划痕的宽度，计算DOHH-2细胞迁移速率。每组重复6次。

1.8统计方法 采用Graphpad Prism6进行单因素方差分析、SNQ检验。

2 结 果

2.1各组细胞miRNA-200a、PTEN mRNA及蛋白表达比较 与对照组或阴性对照组比，miRNA-200a转染组的miRNA-200a水平显著增高(P<0.05)，PTEN水平显著降低(P<0.05)，对照组和阴性对照组的miRNA-200a、PTEN mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，这表明miRNA-200a干扰模型构建成功，miRNA-200a mRNA负调控PTEN mRNA及蛋白的表达。见表2和图1、2。

2.2各组细胞的增殖和迁移 与对照组或阴性对照组比，miRNA-200a转染组的相对细胞活力和细胞迁移速率明显增高(P<0.05)，这表明miRNA-200a依赖PTEN调控DOHH-2细胞的增殖和迁移。见表2。

表2 各组miRNA-200a、PTEN mRNA和蛋白表达及细胞增殖和迁移比较

与对照组比：1)P<0.05，与阴性对照组比：2)P<0.05

1：对照组；2：阴性对照组；3：miRNA-200a转染组；图2同图1 miRNA-200a及PTEN mRNA表达

图2 miRNA-200a及PTEN蛋白表达

3 讨 论

miRNAs是一类长度为18～22 bp的非编码RNA，其对于调控靶向mRNAs的基因表达十分重要〔7,8〕。最初在秀丽隐杆线虫中发现了miRNAs导致转录后基因沉默的现象〔9〕。miRNAs参与多种生命过程，包括细胞凋亡、分化和增殖。它们涉及多种疾病，如免疫系统疾病、神经系统疾病和肿瘤〔10〕。以往的证据表明许多miRNAs参与肿瘤发生。尽管miRNA仅占哺乳动物基因组的1%，但超过50%的miRNA基因位于与癌症中的突变的DNA序列中〔11〕。许多肿瘤的miRNA表达谱发生了特异性的改变，例如，在B细胞慢性淋巴细胞白血病中miR-15和miR-16通常是下调或是被删除的，在Burkitt淋巴瘤患者中miR-155上调了100倍〔11〕。miRNAs可能作为癌基因和抑癌基因参与对肿瘤的调控〔10〕。

PTEN是最常见的肿瘤抑制因子之一，该基因的缺失与癌症显著相关，例如50%～80%的子宫内膜癌患者中该基因发生了突变〔12〕。通过抑制蛋白酶B(AKT)和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PTEN调控细胞的增殖、迁移和凋亡，在肿瘤的发生发展中十分重要〔13〕。已有研究报道了淋巴瘤患者中PTEN表达下调。一项研究表明，在11个弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系中有7个完全丧失了PTEN功能，这表明弥漫性大B细胞淋巴瘤可能与PTEN缺失有关。PTEN表达的缺失也与弥漫性大B细胞淋巴瘤患者较差的生存率有关〔6〕。一些miRNAs，如miR-19a和miR-155等，可以通过调控PTEN进而调控肿瘤的发生〔14〕。

在本研究中，与对照组或阴性对照组比，DOHH-2细胞中miRNA-200a mRNA及蛋白表达的干扰导致PTEN的mRNA及蛋白表达上调，表明miRNA-200a干扰模型构建成功，miRNA-200a mRNA负调控PTEN mRNA及蛋白的表达，CCK8和划痕实验检测显示，miRNA-200a转染组的相对细胞活力和细胞迁移速率明显增高，表明miRNA-200a依赖PTEN调控DOHH-2细胞的增殖和迁移，本研究结果与文献报道类似〔15,16〕。

综上所述，miRNA-200a调控DOHH-2细胞增殖与迁移能力，其机制可能与调控PTEN的表达有关。