当归四逆汤对糖尿病大鼠坐骨神经miR-210、HIF-1α和VEGF表达的影响❋

胡文梅，贾爱明，白长川

(1.大连医科大学中山学院实验中心，辽宁 大连 116085；2.大连医科大学附属第二医院，辽宁 大连 116023；3.大连市中医医院，辽宁 大连 116013)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)能够导致肢端疼痛和感觉迟钝，引发神经性溃疡和截肢。目前关于糖尿病周围神经病变并没有客观有效的治疗方法，中医药防治DPN越来越得到关注。有研究表明，糖尿病是一种缺氧性疾病[1]，而周围神经血流的减少以及随之而来的组织缺氧与DPN发生发展密切相关。关于糖尿病周围神经病变与高糖、缺氧有关，课题组虽已有部分基础研究[2]，发现当归四逆汤有改善DPN作用，而在高糖缺氧诱导下影响血管新生的具体机制涉及许多分子及信号通路，其中微小RNA-210(miR-210)、HIF-1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)对血管新生可能的调控途径及机制尤其值得进一步研究。基于此，本实验通过预防性用药探讨当归四逆汤对糖尿病大鼠坐骨神经miR-210、HIF1-α和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的影响，以期为临床用药提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠30只，6周龄左右，体质量(200±20)g，购于辽宁长生生物技术有限公司。喂养环境温度(22±3)℃，湿度50%，明暗交替12 h。实验经大连医科大学附属第二医院伦理委员会批准(编号2016-9)，动物福利按照国际相关实验动物法规实施。

1.2 主要设备和试剂

当归四逆汤方药，购自大连医科大学附属第二医院药剂科；VEGF-A多克隆抗体、巴傲得、辣根酶标记山羊抗兔IgG，中杉金桥；浓缩型DAB试剂盒，中杉金桥；链脲佐菌素(STZ)、Sigma均购自大连欣华生物；RNAiso Plus，9108，Takara，TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus),RR820 A、Takara，均购自艾科瑞生物工程有限公司；泰盟牌热刺痛仪PL-200型，成都泰盟科技有限公司；生物机能实验系统BL-420F型，成都泰盟科技有限公司；多功能显微镜BX51型，OLYMPUS公司；PCR仪TP600型，宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 糖尿病大鼠模型建立及分组

30只大鼠适应性喂养1周后禁食12 h，除空白对照组大鼠8只按5 ml/kg 腹腔注射柠檬酸缓冲液外，其余大鼠腹腔注射1%的STZ(PH4.4的0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液配制)50 mg/kg。72 h后尾静脉取血后用血糖仪测定血糖，随机血糖>16.7 mmol/L的大鼠被确定为糖尿病模型造模成功。隔日1次监测血糖，血糖过高的大鼠注射胰岛素，以控制观察组大鼠血糖在相似水平(血糖监测至实验结束)。监测血糖1周，造模失败2只剔除实验。可能因血糖过高死亡1只，2只因血糖回落剔除实验。最终造模成功大鼠17只，采用随机数字表法分为2组，其中糖尿病模型组8只，中药预防组9只。

1.4 给药方法

自造模成功1周后起，中药预防组每日灌服1次当归四逆汤(由大连医科大学附属第二医院药剂科煎制，每毫升含生药2.2 g)。每日测体质量后按12 ml/(kg·d)剂量给药，灌胃至12周结束。其余组按12 ml/(kg·d)灌服蒸馏水，每周更换1次灌胃针以保护大鼠。中药预防组大鼠因灌胃不当死亡1只。

1.5 大鼠足底光热刺激痛阈时间测定

造模成功后第12周结束后，测定大鼠足底光热刺激痛阈时间。点亮刺激光源后预热1 min，并设置实验停止时间为30 s，光照强度为50%。将大鼠置于上层方格内，待大鼠静息后移动下层的热源辐射检查箱，使热源发射孔对准大鼠左前足底正中心位置，按动发射键，主机自动计时，大鼠抬脚后计时自动停止。选取同一只大鼠的左后及右后足底，再次测定2次，取3次平均值。

1.6 大鼠坐骨神经传导速度测定

参考文献[3]，造模成功后第12周结束后，分别测定各组大鼠坐骨神经传导速度。

1.7 免疫组化

12周结束，一次性腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠后，俯卧位固定,取左侧梨状肌下缘坐骨神经约1 cm，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水,石蜡包埋,连续切片片厚约3 μm，烤干后4 ℃保存，留做免疫组化。3%H2O2灭活内源性过氧化物酶20 min后，CB缓冲液水浴修复抗原。滴加山羊血清封闭液，于室温孵育15 min后甩去多余液体，勿洗；滴加稀释的VEGF抗体(工作浓度均为1∶50)，置湿盒中37 ℃孵育1 h，4℃过夜；复温至37 ℃，PBS洗3 min/次×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min,PBS洗3 min/次×3 次；滴加辣根酶标记链亲合素(SABC)，置湿盒中37 ℃孵育30 min，PBS洗3 min/次×3 次；DAB显色，显微镜下控制反应时间，有表达后蒸馏水洗5 min/次×3次以终止反应；80%、90%、95%、100%乙醇依次梯度脱水，二甲苯透明中性树胶封片。分别以PBS 抗体缓冲液代替一抗作为阴性对照。显微镜下照相，应用Image-Pro Plus软件测定免疫反应产物蛋白的集成光密度值。

1.8 Real Time PCR

提取RNA作为模板合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。miR-210(71 bp)上游引物GGAGATCTGACCAGGTCATTTGCATAC;下游引物GGGAATTCGATATGACCACACC TGTG，U6(78 bp)为内参：CGCAAGGATGACACGCAAAT; HIF-1α(119 bp)上游引物TCTAGTGAACAGGATGGAATGGAG，下游引物TCGTAACTGGTCAGCTGTGGTAA，β-actin(150 bp)上游引物GGAGATTACTGCCCTGGCTC CTA，下游引物GACTCATCGTACTCCTGC TTGCTG。应用SYBR Green I荧光染料嵌合法，以空白对照组样品提取的Total RNA(500 ng/μl)反转录获得的cDNA作为标准品，分别制作U6、β-actin基因和miR-210、HIF-1α基因的标准曲线。将各组样品(100 ng)分别在U6、β-actin基因和miR-210、HIF-1α基因标准曲线上进行定量实验，并进行目的基因的相对表达量分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 12周各组大鼠空腹血糖、热痛觉、坐骨神经传导速度比较

表1示，与BC组比较，DM组大鼠血糖升高(P<0.05)，足底光热刺激痛阈时间增长(P<0.05)，大鼠坐骨神经传导速度减慢(P<0.05)。与DM组比较，MP组血糖差异无统计学意义(P>0.05)，足底光热刺激痛阈时间缩短(P<0.05)，大鼠坐骨神经传导速度增快(P<0.05)。

2.2 12周各组大鼠坐骨神经组织内VEGF表达比较

图1表1示，各组大鼠坐骨神经的中小神经元细胞、神经膜、轴突和髓鞘中均可见到VEGF阳性细胞。VEGF的免疫组化表达经IPP图像分析，计算IOD值。

图1 各组大鼠坐骨神经组织内VEGF免疫组化表达

表1 大鼠空腹血糖、足底光热刺激痛阈时间、坐骨神经传导速度、VEGF蛋白表达平均积分光密度值及miR-210、HIF-1αmRNA水平比较

注：与空白对照组比较：#P<0.05；与糖尿病模型组比较：*P<0.05

2.3 12周各组大鼠坐骨神经miR-210、HIF-1αmRNA水平比较

表1示，与BC组比较，DM组miR-210、HIF-1αmRNA 水平降低(P<0.05)；与DM组比较，MP组miR-210、HIF-1αmRNA明显增高(P<0.05)。

3 讨论

本研究以中医“孙络-微血管”理论作为切入点，研究糖尿病周围神经病变，不仅体现中医特色，而且通过检测HIF-1α、miR-210、VEGF等相关表达，使中医宏观脉络理论与分子生物学的微观世界相互联系及印证，为经典方剂的开发提供理论依据。

“孙络-微血管”作为维持脉络末端营卫交会生化的基本功能单位，当其发生病变时可引发营卫交会生化异常，孙络损伤不通成为多种脉络病变的重要因素，且贯穿于脉络病变的始终[4]。当归四逆汤出自《伤寒论》，由当归、桂枝、芍药、细辛、甘草、通草、大枣组成，具有养血祛寒通脉功能，正合DPN中医病机。临床治疗血虚受寒、寒凝经脉、血行不畅之手足厥寒，以肌肤麻木不仁、疼痛、脉涩为主要症状，归属于孙络病变，与DPN 临床表现相符，临床应用当归四逆汤，可以较好地改善DPN症状。

基于糖尿病是一种缺氧性疾病，DPN机制研究热点之一是聚焦于微血管病变，认为微血管病变导致神经纤维缺氧，是DPN最重要的原因之一，因此缺氧调节及血管再生相关指标尤其值得关注。VEGF是一种强效促进血管再生因子，特异性地作用于血管内皮细胞，能刺激内皮细胞增殖、迁移和体内血管的形成。HIF-1α是HIF-1介导的应对低氧细胞应答的关键因素，而HIF-1作为一种转录因子，在低氧条件下可通过促进VEGF 基因转录，在调节组织血管生成中发挥重要作用[5]。miR-210 在缺氧导致的血管生成及内皮细胞存活过程中也发挥着重要作用[6]。miR-210 的表达受缺氧诱导后，可调控缺氧反应相关基因的表达，提示miR-210 有可能成为诊治包括缺血缺氧性损伤等多种疾病的新靶点，故本实验选择HIF-1α、miR-210、VEGF指标。

本研究以SD大鼠作为研究对象，结果显示12周后当归四逆汤中药预防组血糖值与糖尿病模型组比较无明显差异，但可以缩短大鼠足底光热刺激痛阈时间，增加坐骨神经传导速度，提升大鼠坐骨神经组织的VEGF表达水平，提示中药预防治疗可以调控VEGF功能，促进血管再生，并能提高HIF-1α、miR-210水平，因而推测其调节机制可能与HIF-1α-miR-210-VEGF通路有关，其机制可能如下。

Puissegur 等研究证实，miR-210 与HIF-1可形成一个前馈回路，提示miR-210 与HIF-1密切相关[7]。miR-210一方面受HIF-1α调控，另一方面可调控VEGF功能，促进血管生成。在细胞对缺氧反应中起中枢纽带作用。VEGF水平与DPN密切相关，可能是引起不同组间热痛觉和神经传导速度出现差异的原因之一。与糖尿病模型组恰恰相反，中药干预组VEGF水平和miR-210、HIF-1α都呈现出较高水平的表达，故推测当归四逆汤抗DPN作用机制可能是通过调控HIF-1α—miR-210—VEGF通路实现的，即当归四逆汤可上调HIF-1α，而HIF-1α进一步上调靶基因miR-210表达，进而增强VEGF表达，促进血管新生进而保护大鼠坐骨神经。同时在糖尿病模型组及中药治疗组中，2组大鼠血糖比较差异无统计学意义，考虑其改善DPN的机制与血糖控制的关系不大。我们还需认识到，当归四逆汤干预DPN的这一通路的相关因素或其他分子通路仍需进一步研究。

通常为说明治疗方法的有效性，实验常要设置阳性对照试验组，而本实验设计中限于主客观条件，未设置阳性对照药物组，这样造成实验结果虽可说明该中药方有效，但难以证明此疗法优于或等效于目前其他药物，是实验设计缺陷，在日后进一步实验中需考虑增设。

鉴于miR-210、HIF-1α在缺氧时表现的突出作用，我们可以预见，研发中医药调控miR-210、HIF-1α，极有可能成为治疗缺氧性疾病包括糖尿病及其慢性并发症的新靶点。