骨髓活检塑胶包埋在以单纯血小板减少为表现的骨髓增生异常综合征诊断中的应用价值

叶成林，姚永华，陈 真，贾 麟

（1.上海市杨浦区市东医院血液科，上海 200438；2.上海国际医学中心肿瘤科，上海 201318）

血小板减少患者常以出血为表现，而其病因则以免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）为多见，但也有其他病因如骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）等，ITP 与以单纯血小板减少为表现的MDS 在临床表现上常难以鉴别，需要进一步行骨髓形态学及骨髓病理检查以明确。临床上常用的石蜡包埋骨髓病理切片，由于其操作中需脱钙等原因，细胞形态不易辨识，常不足以进行鉴别诊断。相比传统的石蜡包埋切片，骨髓活检乙二醇-甲基丙烯酸酯（glycol-methacrylate,GMA）塑胶包埋切片中的造血细胞形态明显优于传统切片，便于细胞形态学的辨识，尤其是GMA塑胶包埋过程控制在制冷体系下，使热敏感抗原保留较佳。浦杰等[1]曾在52例血液病患者的骨髓活检GMA 包埋切片中对14 种单克隆标志物的表达进行观察，证明该技术既可保留良好的抗原性，也有助于观察免疫组织化学（免疫组化）标志物相关的形态学细节。本研究通过骨髓活检GMA 塑胶包埋技术结合巨核细胞免疫标记方法，从47例以单纯血小板减少为表现的患者中诊断出8例MDS 患者，现报告如下。

资料与方法

一、资料

2014 年8 月至2018 年10 月期间，选取来我院门诊就诊及住院的47例临床表现为单纯血小板减少的患者，其中男性20例，女性27例，年龄为46～84岁，平均年龄为72岁。

二、方法

1.骨髓活检GMA 塑胶包埋：参考《实用血液病骨髓病理学彩色图谱》相关内容[2]，制备包埋剂甲液和乙液。取固定好的骨髓活检组织块，浸于起始浓度为70%并逐级递增的乙醇中进行脱水；将脱水后的骨髓活检组织块用针头挑入特制的聚乙烯模具中，用滴管吸取GMA 单体甲液装满模具，并放入4 ℃的冰箱中浸泡2 h；用带8 号针头的1 mL 注射器吸取乙液 （聚乙二醇和N-N 二甲基苯甲胺混合液），滴3 滴入模具中，用细玻璃棒迅速将甲、乙两液搅匀，并将活检块摆正在模具底部中央，置于4 ℃冰箱内，放置60 min 待其自聚；取出制作好的塑胶包埋块，切割成3～4 μm 厚的切片。

2.免疫组化染色：选择CD41 单抗免疫标记染色以区分小微巨核等病态巨核细胞，选择CD33 单抗标记未成熟前体细胞异常定位 （abnormal localization of immature precursors,ALIP）结构中的前体细胞，用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase,APAAP） 方法染色，所用试剂盒购自美国DAKO 公司，操作步骤如下。将骨髓活检组织切片从-20 ℃冰箱中取出后，在室温下放置15～20 min，用磷酸缓冲盐溶液洗片3 次，再加入马血清封闭20 min，依次加入一抗（鼠抗人单克隆抗体）、二抗（羊抗鼠免疫球蛋白）、三抗（APAAP 酶标复合物），并分别于室温下各孵化2 h、40 min 和40 min，最后滴加显色液显色20 min。

3.细胞遗传学检查：对骨髓活检组织进行染色体核型分析及MDS 相关基因检查。检查均送至上海金域医学检验有限公司进行，检测过程均符合细胞遗传学实验技术标准操作规程。

4.MDS 的诊断和分型标准：MDS 的诊断和分型均依据WHO（2016）的MDS 分型标准，其中骨髓任何系病态造血以病态发育细胞＞10%为标准[3]。

结果

一、诊断结果

在47例患者中，8例患者经病理诊断诊断为MDS，占血小板减少总人数的17%，其中男性3例，女性5例，其余39例患者被诊断为ITP 或其他非血液系统疾病所致的血小板减少患者。8例MDS 患者中3例为MDS 伴单系病态造血（myelodysplastic syndrome-single lineage dysplasia，MDS-SLD），4例为MDS 伴多系病态造血（myelodysplastic syndrome with multilineage dysplasia，MDS-MLD），1例为5q-综合征。3例患者在入院前已诊断或拟诊为免疫性血小板减少性紫癜，但治疗效果不佳。8例MDS 患者就诊时的平均血小板计数为18×109/L [（9～30）×109/L]（见表1）。

二、骨髓活检病理表现及免疫组化染色结果

骨髓病理检查可见，粒系、红系、巨核系和淋巴系细胞显示良好，细胞形态清晰，5例患者表现为多系病态造血，3例患者表现为单系病态造血。6例MDS 患者的骨髓组织骨小梁间中心区可观察到真性ALIP 结构（即5～6个以上的未成熟前体细胞集聚），未成熟细胞的核膜清晰，可见核仁（见图1A），并可见骨小梁旁同期幼红细胞簇，主质内可见大、小簇ALIP 结构，ALIP 结构中粒系前体细胞呈CD33 染色强阳性（见图1B、1C）。

表1 患者基本情况及病态造血、细胞遗传学检测结果

8例MDS 患者均可观察到巨核系病态造血，可见巨大巨核细胞（见图1D），而免疫组化染色可见微巨核细胞（见图1E），其数量超过巨核细胞总数的10%。2例患者的骨髓组织切片中可见网状纤维（+）（见图1F）。

三、细胞遗传学检测结果

8例MDS 患者中有3例染色体核型分析及基因检查异常，可见t（1，21）、5q-、7q-等（见表1）。

讨论

单纯血小板减少的患者在临床上很常见，而以血小板减少为主要表现的MDS 与ITP 的鉴别方法目前主要集中在血清血小板生成素、外周血网织血小板以及骨髓细胞高碘酸希夫染色结果三方面。关于血清血小板生成素的水平差异，文瑞婷等[4]研究了117例血小板减少症患者后发现，MDS 组、ITP组与正常对照组比较，血清血小板生成素水平差异无统计学意义，可能需要在低增生MDS 及其他类型MDS 亚型间行分层研究。外周血网织血小板是骨髓释放入血的含有少量粗面内质网及mRNA 的新鲜血小板，其数量反映了人体血小板的更新能力，ITP 患者发病时网织血小板减少。但研究发现，采用网织血小板计数鉴别MDS 与ITP 的作用有限[5]。MDS 患者有核红细胞阳性率较高，提示红系存在病态造血，骨髓细胞高碘酸希夫染色阳性者的骨髓巨核细胞总数及淋巴样小巨核细胞数量及比例升高，但营养性贫血等其他病因患者亦可呈现类似表现[6]。因此，临床需要寻找更好的方法对两者进行鉴别。

图1 骨髓活检组织病理图片

一、骨髓活检GMA 塑胶包埋

骨髓穿刺细胞学检查是血液病诊断的基本方法，而骨髓活检组织检查更容易发现骨髓的增生程度、基质细胞、纤维化、细胞定位等方面的信息，尤其对于MDS，病态造血是其诊断的核心所在，对其诊断的意义更大[7]，将二者结合可以提高血液病的诊断率，减少漏诊及误诊[8]。脱钙的石蜡切片中细胞易皱缩，结构易被破坏，而GMA 塑胶包埋材料技术为不脱钙包埋技术，包埋过程控制在低温-低氧环境下进行，可有效防止热损伤，热敏感抗原保留较佳，这样医师不仅能观察造血组织的结构、清晰地分辨造血细胞的各个阶段[9],还能结合免疫标志物进一步辨别特异性的巨核系病态造血表现，可更精确地作出诊断。

二、巨核细胞免疫标记

有研究表明，在ITP 和MDS 患者中，巨核细胞的凋亡均呈现减少[10]，而巨核系病态造血，细胞多形性明显，包括不产生血小板的巨大及双核巨核细胞，极易与ITP 混淆。在病态造血的多种表现中，小微巨核细胞虽难以识别，但诊断特异度较高[11]。因此，正确识别巨核系病态造血是鉴别MDS 与ITP的关键。小巨核及微巨核细胞形态上难以被识别，产板是巨核细胞的特征，一定数量的小巨核细胞产板现象是巨核系病态造血的最重要特点，需要仔细观察，避免疏漏。

通过免疫组化甚至涂片细胞化学染色的方法可以进一步标记巨核细胞。2010 年国际MDS 血液病理学工作会议建议，骨髓石蜡切片选择1～2个巨核细胞标志 物，包 括CD42b、CD61 及CD31 及CD41，而本研究中采用的CD41 免疫标志物染色有助于识别小微巨核等病态巨核细胞，对巨核系病态造血的诊断有意义。

三、ALIP 结构鉴别

ALIP 结构也是支持MDS 诊断的重要依据，但需要注意部分低危MDS 中可见由红系等前体细胞形成所谓“假性ALIP”结构，其多呈小簇分布（未成熟前体细胞一般不超过5～6个），而行免疫组化检测可帮助鉴别，明显的大簇ALIP 结构可见未成熟细胞集聚现象，有益于诊断MDS。本研究中图1B和1C 亦证实了组成ALIP 结构的是CD33 阳性粒系前体细胞，为“真性”ALIP 结构。浦权等[2]使用CD33 来标记ALIP 结构中的前体细胞，本研究沿用此方法，主要考虑CD33 在髓系早期细胞表达，在造血干细胞和成熟细胞上均不表达，特异度相对较高。有研究认为，采用CD34 标记ALIP 结构中的前体细胞，其对MDS 的诊断意义更大[12]，但本研究考虑CD34 除在造血干和（或）祖细胞表达外，还可能在内皮细胞中表达，建议进一步行研究探索以验证。

四、细胞遗传学异常

特征性的细胞遗传学异常是诊断MDS 的另一个重要依据。本研究诊断的8例MDS 患者中有3例检出染色体异常，包括5q-及7q-，但有1例患者为t（1，21），意义不明，有待进一步研究。部分患者检出有意义的细胞遗传学异常（如5q-），但无病态造血证据，如符合诊断标准应诊断为ITP，但需密切随访，不排除意义未明的克隆性血细胞减少，警惕病情转化可能[13]。

MDS 作为血液肿瘤性疾病，常伴随不同程度的网状纤维增生，而ITP 则极少出现纤维化，即使出现，程度也较轻[14]。因此，是否存在网状纤维增生可作为二者鉴别的证据之一。

总之，采用骨髓活检塑胶包埋及免疫组化技术，结合骨髓穿刺细胞形态学检查及细胞遗传学检查，可以提高MDS 的诊断率。细胞形态学检查结果提示巨核细胞病态造血，免疫组化检测发现一定比例的小、微巨核细胞，组成主体为粒系前体细胞且呈大簇分布的ALIP 结构、网状纤维增生，检出MDS 常见的细胞遗传学异常，以上均高度提示MDS。尤其对于单纯血小板减少且常规ITP 治疗方案无效的患者，应考虑MDS 的可能。但GMA 塑胶包埋及免疫组化技术相对石蜡包埋而言，对于技术层面的要求高，且不利于后续活检组织的免疫组化染色，大规模普遍推广受限，实用方面仍有很大的局限性，需要进一步探讨及研究。