不同炮制方法对熟地黄中7种化学成分含量的影响

李 娴，邢亚东，李姗姗，刘 浩

地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根。始载于《神农本草经》，列为上品，现代被誉为“四大怀药”之一。生地黄经不同炮制方法，加工成熟地黄后，其药性由寒转温，味由苦转甘，功效由清转补，具有补血滋阴、益精填髓的功效[1]。熟地黄临床应用广泛，属于高配方频度中药之一。然而因其味甘而腻，易于助湿生满，有碍脾胃消化吸收，病人服用后，会出现滋腻碍胃的现象，即胃纳欠佳、腹胀、便溏等反应[2]。明代李时珍在《本草纲目》首次记载用酒和砂仁炮制地黄，指出因熟地黄质厚味浓，滋腻碍脾，酒制后其性转温，主补阴血，并可借酒力行散，起到行药势、通血脉的作用，同时借助砂仁香窜之性，合和五脏冲合之气，归宿丹田。

目前熟地黄常用的炮制方法有2015版《中国药典》中收录的清蒸法和酒炖法，这两种炮制方法中均未加入辛香类药物。2005版《河南省中药饮片炮制规范》中收录的九蒸九晒法，加入了砂仁。因此，本实验分别选用清蒸法、酒炖法和九蒸九晒法3种方法炮制的熟地黄为供试品，通过建立HPLC法同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分含量，考察不同炮制方法对熟地黄主要化学成分的影响，以期为熟地黄临床应用和综合开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 赛默飞UltiMate3000型高相液相色谱仪(美国赛默飞科技公司，配置在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器)，赛默飞色谱工作站(美国赛默飞科技公司)；KQ-600KDE1超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司；XS105分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；FW100粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试剂与样品 梓醇(中国食品药品检定研究院，批号：110808-201711，纯度99.6%)，益母草苷(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：YA220607，纯度≥98%)，地黄苷A(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：DR192237，纯度≥98%)，地黄苷D(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：DR210025，纯度≥98%)，毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院，批号：111530-201713，纯度92.5%)，异毛蕊花糖苷(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：YI3306019，纯度≥98%)，5-HMF(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201711，纯度99.4%)，甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地有限公司)，磷酸为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)，水为娃哈哈纯净水。

黄酒(中国绍兴黄酒集团有限公司，生产批号：20170627，酒精度15%)；地黄Rehmanniae Radix(产地河南)、砂仁Amomi Fructus(产地广东)，均购自蚌埠医学院第二附属医院，经蚌埠医学院王迪生副教授鉴定，符合《中国药典》2015年版要求[5]。

1.3 HPLC色谱条件 色谱柱：赛默飞C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序为：0～8 min，1%B；8～9 min，1%～4%B；9～25 min，4%B；25～35 min，4%～20%B；35～50 min，20%B；50～50.01 min，20%～1%B；50.01～55 min，1%B。柱温：30 ℃；检测波长：203 nm、332 nm，波长切换：0.00～29.00 min，波长203 nm，29.01～55.00 min，332 nm；进样量：1 μL。

1.4 供试品的制备

1.4.1 清蒸熟地黄的制备 取生地黄，蒸制12 h，闷12 h后，上下翻动1次，如此反复蒸闷2次，70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出，放凉即得[3]。

1.4.2 酒炖熟地黄的制备 取生地黄，加入黄酒拌匀，每100 kg生地黄用黄酒40 kg[3]，闷润至酒吸尽，连续炖制48 h后(炖制24 h时，上下翻动1次)，70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出，放凉即得。

1.4.3 九蒸九晒熟地黄的制备 取生地黄，加黄酒适量拌匀一段时间后闷润至酒吸尽，以武火加热，用容器收集流出的熟地黄汁，蒸约48 h至地黄中央发虚为度，取出，晒1 d；再拌入熟地黄汁和黄酒，再蒸24 h，取出再晒1 d；如此反复，蒸晒8次。至第9次，将黄酒与砂仁粉一起拌入，蒸24 h，以蒸至内外漆黑，味甜酸无苦味为度，取出即得。每100 kg生地黄用黄酒50 kg、砂仁粉0.9 kg[4]。

1.5 对照品储备液的制备 分别取梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解制成质量浓度分别为2.189 2、2.165 8、2.035 0、3.557 4、2.244 2、2.016 8、2.062 6 mg/mL的混合对照品储备液。

1.6 供试品溶液的制备 取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄经粉碎(过4号筛)所得的粉末约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，精密称重，30 ℃水温超声处理40 min，过滤，放冷，补重，精密量取滤液25 mL，水浴蒸干，残渣加10%乙腈溶解，转移至10 mL量瓶中并定容，备用。

1.7 系统适用性 分别取混合对照品溶液和供试品溶液，按“1.3 HPLC色谱条件”进样分析，各色谱峰的拖尾因子均在0.95～1.05之间，与相邻色谱峰的分离度大于1.5，梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的理论塔板数均大于6 800。

2 结果

2.1 HPLC定量方法学考察

2.1.1 专属性 通过比较空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的色谱图考察专属性。结果表明，供试品溶液中其他成分对待测成分无干扰，分析方法专属性良好，色谱图见图1～3。

2.1.2 检测限与定量限 取各对照品溶液适量，加入甲醇溶液逐步稀释，以信噪比3时对应待测物浓度为检测限，以信噪比10时对应待测物浓度为定量限进行测定，结果见表1。

表1 各对照品的检出限和定量限

2.1.3 线性与范围 分别精密量取梓醇、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、5-HMF对照品储备液适量置5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得浓度分别为271.46、12.99、40.70、711.48、224.42、806.74、309.38 μg/mL的混合对照品工作液。按高效液相色谱条件分别精密吸取混合对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5 μL，依法测定，记录色谱峰的峰面积，以各对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归计算，结果见表2。

表2 各成分线性关系

2.1.4 精密度 精密吸取对照品溶液，在色谱条件下进样6次，每次5 μL，测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.41、0.67、1.14、1.88、0.33、1.71、0.46，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性 精密吸取同一供试品溶液，在色谱条件下分别于0、1、3、5、12、24 h测定，测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.38、0.94、1.19、0.94、0.70、0.90、0.45，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性 取清蒸熟地黄，按1.6方法平行制备供试品溶液6份，在色谱条件下，测得毛梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.81、0.85、1.36、1.36、0.67、1.22、0.42，表明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率 精密称取清蒸熟地黄粉末9份，每份1 g，精密秤定，精密加入对照品适量。按“1.6”项下方法制备供试品溶液，在色谱条件下，测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF平均加样回收率RSD分别为1.51、1.14、1.14、0.84、1.44、1.23、1.28。

2.2 样品含量测定 取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄各约2 g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下操作，制备供试品溶液，按“高效液相色谱条件”进样5 μL，测定峰面积，采用外标法对梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的含量进行测定，结果见表3。

表3 样品测定结果(n=3)

3 讨论

本实验首次建立了同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF含量的HPLC方法。测定了熟地黄3种不同炮制品，即清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄中以梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D为主的环烯醚萜苷类成分，以毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷为主的苯丙素苷类成分，以及5-HMF的含量。实验预试中，经查阅文献，5-HMF的提取方法主要有水浴回流提取和超声提取两种方法[5]。考虑到回流提取的加热过程中，可能会使熟地黄中的多糖自身发生水解、脱水反应生成5-HMF，导致5-HMF含量偏高，实验数据不准确。故本实验采用超声提取方法，制备供试品溶液。

本实验结果显示，生地黄中不含5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中，环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解；环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低；可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解；可以检测到5-HMF。

通过实验数据分析可知，由于梓醇和益母草苷都是环烯醚萜单糖苷，热稳定较差，地黄经过清蒸、酒炖和九蒸九晒加热过程后，其含量降低至几乎全部降解。地黄苷A和地黄苷D是环烯醚萜双糖苷，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷属于苯丙素苷，均相对稳定，在清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中均可以检测到，但较生地黄含量下降。可能因为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为咖啡酸酯，在炮制过程中发生酯键的断裂，从而生成咖啡酸[6]。而九蒸九晒熟地黄蒸晒次数较多，上述成分几乎全部降解。地黄在清蒸、酒炖和九蒸九晒过程中发生了Maillard 反应，生成了5-HMF。5-HMF在含糖中药的炮制过程中都有可能生成，与炮制时间和温度密切相关，现已成为中药炮制原理研究的活性成分，具有抗心肌缺血、抗氧化、降血糖、改变血液流变性和神经保护性作用[5]。

综上，通过测定熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量，可知不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大，尤其是九蒸九晒熟地黄在反复蒸晒过程中苷类逐渐降解，其生成何种化合物，与九蒸九晒熟地黄增效袪腻药效变化是否有关，值得进一步深入研究。