养血清脑颗粒对认知功能障碍大鼠学习、记忆及GAP-43、PSD-95表达的影响

叶海森 陈曦 李韧娇

摘要 目的：探讨养血清脑颗粒对认知功能障碍大鼠学习、记忆及GAP-43、PSD-95表达的影响。方法：采用双侧颈动脉永久性结扎法构建认知功能障碍大鼠模型，将大鼠随机分为模型组与实验组，每组18只。假手术组（n=15）大鼠仅分离、暴露颈动脉，不结扎。实验组灌胃养血清脑颗粒10 mL/（kg·d），假手术组与模型组灌胃等量生理盐水，连续干预4周。测定各组大鼠的学习记忆能力;HE染色观察大鼠海马组织病理学变化;TUNEL检测海马神经元凋亡情况;Wb法检测海马组织GAP-43和PSD-95蛋白表达。结果：与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期与游泳路程延长，跨越原平台次数减少，记忆成绩下降，神经元凋亡指数与海马组织PSD-95蛋白相对表达量升高，而GAP-43蛋白相对表达量降低，且以上指标实验组均优于模型组（均P<0.05）。结论：养血清脑颗粒可改善认知功能障碍大鼠的学习记忆能力，抑制神经元凋亡，其机制可能与上调海马组织GAP-43蛋白表达，下调PSD-95蛋白表达相关。

关键词 认知功能障碍;养血清脑颗粒;学习;记忆;GAP-43;PSD-95

Abstract Objective：To investigate the effects of Yangxue Qingnao Granules on learning，memory and expression of GAP-43 and PSD-95 in rats with cognitive impairment.Methods：A bilateral carotid artery permanent ligation was used to construct the rat models of cognitive dysfunction，and the rats with cognitive impairment were randomly divided into a model group and a test group，with 18 rats in each group.Rats in the sham-operation group（n=15）only isolated and exposed the carotid arteries without ligation.Rats in the test group were administered with Yangxue Qingnao Granules 10 mL/（kg·d） by gavage.The sham-operation group and the model group were perfused with the same amount of normal saline，and the intervention was continued for 4 weeks.The learning and memory ability of rats were detected in each group; histopathological changes in hippocampus of rats by HE staining was observed; TUNEL was used to detect hippocampal neuron apoptosis in each group of rats; Wb method was used to detect the protein expression of GAP-43 and PSD-95 in hippocampus of rats.Results：Compared with the sham-operation group，the escape latency and swimming distance of the model group were significantly longer，the number of times to cross the original platform significantly reduced，the memory score significantly decreased，the apoptosis index of hippocampal neurons and the relative expression of PSD-95 protein in the hippocampus significantly increased in the model group，but the relative expression of GAP-43 protein significantly reduced，and the above indicators were better in the test group than in the model group（all P<0.05）.Conclusion：Yangxue Qingnao Granules can improve the learning and memory ability，inhibit neuronal apoptosis，and its mechanism may be related to up-regulating the expression of GAP-43 protein and down-regulating the expression of PSD-95 protein in hippocampus.

Keywords Cognitive dysfunction; Yangxun Qingnao Granules; Learning; Memory; GAP-43; PSD-95

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是指由各种脑血管因素引起的脑组织损害，并伴有严重认知功能障碍的综合征，是一种慢性的进行性疾病，属于中医学“痴呆”范畴，其发病机制较为复杂，目前尚无有效的治疗手段[1-2]。近年来，中药在VD治疗中的作用逐渐引起关注。养血清脑颗粒是在中医名方“四物汤”的基础上改良而成的中药复方制剂，具有滋阴养血、活血通络、平肝潜阳等功效，临床上常用于治疗脑血管疾病[3]。文献[4]报道，养血清脑颗粒对慢性脑供血不足患者认知功能障碍及脑血流均有改善，且安全有效，但具体的作用机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨养血清脑颗粒对大鼠双侧颈动脉结扎所致认知功能障碍的改善作用及其作用机制，以期为其临床推广应用提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级，雄性SD大鼠，6～7周龄，体质量220～250 g，购于赛业模式生物研究中心（太仓）有限公司，动物生产合格证号：SCXK（苏）2018-0003。饲养环境：饲养于屏障环境动物实验室，每5只1笼，温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，光照明暗时间比为12 h/12 h，自由获取食物和水。

1.1.2 药物 养血清脑颗粒（天士力医药集团股份有限公司，国药准字Z10960082）。

1.1.3 试剂与仪器 苏木精-伊红（HE）染色液（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0061R）;TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）凋亡试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：T2190）;兔抗鼠生长相关蛋白-43（GAP-43）抗体（英国Abcam公司，批号：ab16053）;兔抗鼠突触后致密物质-95（PSD-95）抗体（美国Santa Cruz公司，批号：150409）等。切片机（上海亿欣生物科技有限公司，KD-2800型）;臺式冷冻离心机（德国Eppendorf公司，5417R型）;倒置荧光显微镜（德国Leica公司，DMI30B1型）;多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，M200 PRO型）;QuantityOne 1-D分析软件（美国Bio-Rad公司）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用双侧颈动脉永久性结扎的方法构建认知功能障碍大鼠模型：10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，颈前部备皮。颈正中线左侧旁开0.5 cm处行长约1 cm切口，钝性分离颈总动脉，4号丝线双重结扎;7 d后于颈正中线右侧旁开0.5 cm处行同样切口，并进行相同手术操作。另选择15只大鼠作为假手术组，仅做颈前切口，将双侧颈动脉分离、暴露，但不结扎。采用Morris水迷宫实验判断认知功能障碍大鼠模型是否构建成功，连续5 d，计算模型鼠逃避潜伏期均值与参考值（假手术组大鼠逃避潜伏期5 d的均值）之差以及差值与该均值的比值，若比值>20%，即表示造模成功。将成功建立的36只认知功能障碍大鼠随机分为模型组及实验组，每组18只[5]。

1.2.2 给药方法 实验组大鼠给予养血清脑颗粒[10 mL/（kg·d），浓度为0.32 g/mL]灌胃，假手术组与模型组等量生理盐水灌胃，3组均连续干预4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 Morris水迷宫实验[6]与Y型迷宫实验[7]测定大鼠的学习记忆能力 1）末次干预后进行Morris水迷宫实验：a.定位航行试验：将大鼠依次从4个象限放入水中，记录120 s内寻找平台的时间（逃避潜伏期）;若大鼠在120 s内未找到平台，逃避潜伏期记为120 s。实验历时5 d，取平均值。b.空间搜索试验：撤除平台，计算大鼠120 s内跨越原平台的次数及游泳的轨迹。2）Y型迷宫实验：a.学习能力测试：大鼠放入Y型迷宫适应5 min后施加电刺激（电压60 V，延时5 s）。大鼠受到电击后一次性逃往安全区判为正确反应，并让其在安全区停留30 s。当大鼠连续10次训练中有9次正确反应，则表示学习合格。记录大鼠达到9/10标准前所需的训练次数，以表征其学习成绩。b.记忆能力测试：训练结束后24 h，按上述方法训练大鼠10次，记录正确反应次数作为记忆成绩，以评价记忆能力的高低。

1.2.3.2 HE染色[8]观察大鼠海马组织病理学变化各组大鼠学习记忆能力测定后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，分离、采集海马组织，4%多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片，进行HE染色，光学显微镜下观察海马组织病理学特点。

1.2.3.3 TUNEL法[9]检测大鼠海马神经元凋亡情况 取石蜡切片，按照TUNEL凋亡试剂盒说明书进行操作。细胞核染为绿色为阳性细胞，即凋亡细胞，于倒置荧光显微镜下观察并计数阳性细胞数，计算细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.3.4 蛋白免疫印迹（Wb）法[10]检测大鼠海马组织GAP-43、PSD-95蛋白的表达水平 取-80 ℃保存的海马组织，加入裂解液在冰浴环境中匀浆，4 ℃条件下，12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法检测蛋白浓度。取待测蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后封闭，加入一抗GAP-43、PSD-95，4 ℃孵育过夜，加入二抗。采用QuantityOne 1-D图像处理分析软件分析各条带的灰度值，以目的条带灰度值/β-actin条带灰度值确定目的蛋白相对含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较 与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，实验组短于模型组;跨越原平台次数明显减少，实验组多于模型组;游泳路程明显延长，实验组短于模型组（P<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠Y型迷宫实验结果比较 与假手术组比较，模型组大鼠达到9/10标准所需的训练次数明显增加，且实验组少于模型组（P<0.05）;记忆成绩明显下降，实验组高于模型组（P<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠海马组织病理学变化 假手术组大鼠海马神经元形态完整，排列整齐、紧密;模型组大鼠海马神经元形态异常，结构不清晰，排列紊乱，细胞质减少，且细胞核固缩，部分出现空泡变性现象;实验组大鼠海马神经元细胞上述形态学改变较模型组均明显减轻。见图1。

2.4 各组大鼠海马神经元凋亡情况 假手术组、模型组与实验组大鼠海马神经元的凋亡指数分别为（11.41±2.37）%、（54.32±4.78）%、（37.43±4.21）%。与假手术组比较，模型组大鼠海马神经元的凋亡指数明显升高，且实验组低于模型组（P<0.05）。见图2。

2.5 各组大鼠海马组织GAP-43、PSD-95蛋白的表达水平 假手术组、模型组与实验组大鼠海马组织GAP-43蛋白相对表达量分别为（0.95±0.05）、（0.13±0.06）、（0.51±0.12），PSD-95蛋白相对表达量分别为（0.06±0.04）、（0.96±0.04）、（0.25±0.11）。与假手术组比较，模型组大鼠海马组织GAP-43蛋白相对表达量明显降低，且实验组高于模型组（P<0.05）;PSD-95蛋白相对表达量升高，且实验组低于模型组（P<0.05）。见图3。

3 讨论

中医学理论认为VD属中风后痴呆范畴，其基本病机是肾虚髓亏，常发于老年人;而VD的发病基础是肾精渐衰，脑髓失养，加之中风后脑络瘀阻，气血精津阻滞，导致痰、瘀、浊毒停滞脑髓，脑窍失充，使元神失养，清窍不清，从而出现神思迟钝、善忘等症状[11]。VD的发病机制十分复杂且尚未完全明确，因此临床上可用于治疗VD的有效药物较少。近年来，中医药在治疗VD方面具有一定的优势，养血清脑颗粒是采用最新工藝，在中医传统名方四物汤的基础上加减而成的现代中药，其主要成分是当归、川芎、白芍、熟地黄、钩藤、鸡血藤、延胡索、夏枯草、决明子、珍珠母、细辛等，其中当归补血活血，调经止痛;川芎活血行气、白芍滋阴养血;熟地黄益精填髓，补血滋阴;钩藤清热平肝，息风止痉;鸡血藤、延胡索化瘀行气，舒筋通络，补血活血，养血祛风;夏枯草清肝火，解郁结;决明子润肠通便，清肝明目;珍珠母清热平息肝风，潜阳安神;细辛散风通窍止痛，全方具有平肝潜阳、养血活血的作用[12]。研究[13]发现，养血清脑颗粒可改善VD大鼠的学习记忆能力，对VD有治疗作用。本研究结果显示，与模型组比较，实验组大鼠逃避潜伏期与游泳路程均缩短，跨越原平台次数明显增多，同时达到9/10标准所需的训练次数明显减少，而记忆能力升高，提示养血清脑颗粒可改善VD大鼠的学习记忆能力。楼小亮等[14]研究发现，养血清脑颗粒可减轻缺血再灌注脑损伤大鼠脑梗死体积，促进神经干细胞增殖分化，从而利于神经功能恢复。本研究结果显示，实验组大鼠海马神经元的凋亡指数低于模型组，提示养血清脑颗粒可抑制海马神经元凋亡，减轻神经功能损害，进而改善学习、记忆能力。

GAP-43是一种胞膜磷酸蛋白质，与神经再生、突触可塑性及神经系统的发育密切相关，当其表达水平降低时，可损伤神经系统功能，从而影响学习记忆能力;PSD-95可参与突触可塑性的调节和兴奋性突触信号传递，其表达增加可产生兴奋性毒性损伤，导致血管性认知功能障碍[15-16]。文献[17]显示，褪黑素可通过上调GAP-43蛋白表达，改善神经可塑性，促进脑缺血大鼠神经功能的恢复。目前尚未见关于养血清脑颗粒对GAP-43或PSD-95作用的相关研究报道。本研究结果显示，实验组大鼠海马组织PSD-95蛋白相对表达量低于模型组，GAP-43蛋白相对表达量高于模型组，提示养血清脑颗粒可上调VD大鼠海马组织GAP-43蛋白表达，下调PSD-95蛋白表达，从而减轻神经损伤，改善学习记忆能力。

综上所述，养血清脑颗粒可改善VD大鼠的学习记忆能力，抑制神经元凋亡，减轻神经损伤，其机制可能与上调海马组织GAP-43蛋白表达，下调PSD-95蛋白表达相关，这为临床治疗VD提供了新方向，也为养血清脑颗粒的推广应用提供了理论依据。

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（2020-03-02收稿 責任编辑：芮莉莉）