基于MassArray法对PCOS患者DENND1A基因启动子甲基化关联性的研究

郑 水*，杨文娟，袁彦玲，谢正媛，李宝鑫

（1.云南省人口和计划生育科学技术研究所，云南 昆明 650021；2. 昆明医科大学第一附属医院，云南 昆明 650032）

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合征。在育龄妇女中的发生率约为6%～8%[1]，其发病与表观遗传学异常相关。既往有关PCOS表观遗传学的研究集中在DNA甲基化这一现象上。既往研究验证了DENND1A与PCOS发病具有关联性[2]。通过检测DENND1A启动子甲基化的水平，可初步了解DENND1A与PCOS发生的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

病例组为育龄PCOS患者14例，对照组8例。采集患者不含卵子的卵泡液，保存至-20℃备用。

1.2 方法

1.2.1 目标基因序列的生物信息学分析

利用EMBOSS Cpgplot工具测序列潜在的CpG岛并，设计引物设计。

1.2.2 MassArray甲基化检测

卵泡液1000rpm离心后取上清，酚氯仿法提取DNA。DNA样本经过NaHSO3处理后进行PCR扩增；PCR扩增反应体系为ddH2O 4.9μL，含dNTPs的10×PCR Buffer 1.0μL，dNTPs（25mM）0.8μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.6μL，上下游引物（10pmo/μL）各0.2μL，DNA模板2.0μL。2个GpC岛位于引物为5’-aggaagagagGGTGTAGATGTGTAA GGGTTTGTAA-3’， 5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggc tACTTAATCCTAAAACCCATAATCCC-3’，和5’-aggaa gagagGGGATTATGGGTTTTAGGATTAAGT -3’，5’-ca gtaatacgactcactatagggagaaggctAAAAAACCATTTTCAAAA ACTCTCC -3’。PCR扩增程序为94℃ 4min；94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 1min共45个循环；72℃ 5min。PCR扩增产物进行SAP反应，之后进行Mass Cleavage反应。采用Agena MassARRAY Analyzer质谱仪进行检测。

2 结 果

2.1 MassArray甲基化检测结果

2个CpG岛分别检测到27和15个CpG位点，甲基化水平≥10%的CpG位点共有9个（表1）。

表1 甲基化水平≥10%的CpG位点

2.2 两组一般资料和激素水平比较

PCOS 组AMH水平显著高于对照组(P＜0.01)。其余变量两组间差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

表2 两组患者一般临床资料和基础激素水平

3 讨 论

甲基化检测结果表明，DENND1A基因启动子的某些位点确有较高的甲基化水平。对P值的计算结果显示，在所检测的CpG位点中PCOS组和对照组之间无显著性差异。明确PCOS的致病原因有助于疾病本身的早期诊断和治疗，也有助于解释疾病以及并发症的关系。敲除DENND1A.V2蛋白编码基因则同时抑制了CYP17A1 和CYP11A1 基因转录及雄激素合成[3]，因此推断DENND1A 基因对PCOS 患者的高雄表型有着重要影响，但目前尚无PCOS患者DENND1A基因启动子甲基化方面的研究。PCOS发生机制的研究需考虑环境因素引起的表观遗传改变。

甲基化研究方法众多，较为常见的有甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析和焦磷酸测序等。MassARRAY飞行质谱检测系统可实现甲基化定量检测。本研究采用MassArray法对PCOS患者DENND1A基因启动子甲基化进行研究，旨在获得PCOS患者与非PCOS患者在DENND1A基因启动子甲基化的差异。