数据库挖掘ACAA2基因在卵巢癌中的表达及血根碱对其水平的影响*

倪娜，杨艳，张琴，冷天艳，杨丽华

650101 昆明，昆明医科大学第二附属医院 妇科

卵巢癌是女性生殖系统常见三大恶性肿瘤之一，近半个世纪以来，卵巢癌全世界范围发病率上升近2～3倍[1]，在女性生殖系统恶性肿瘤发病率中排名第二，而死亡率却位居妇科肿瘤之首[2]。浆液性卵巢癌是最常见的病理类型，发病隐匿,恶性程度高且预后差[3]。尽管近年来诊疗技术不断改进，但该病仍缺乏有效的筛查手段及早期诊断指标和策略，约70%的患者在初诊时已为晚期卵巢癌，标准的细胞减灭术联合辅助性化疗的治疗方案亦很难达到治愈效果，并且超过70%的晚期患者因化疗耐药在2年内复发，5年生存率仍徘徊在30%，严重威胁着人类健康[4]。因此，探索卵巢癌发病机制，寻找与卵巢癌发生发展相关的关键分子，对于浆液性卵巢癌的诊治具有重要的临床意义。近些年研究显示脂代谢与多项恶性肿瘤疾病的发生发展密切相关。乙酰辅酶A酰基转移酶2(acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2,ACAA2)是脂肪酸氧化步骤中的关键酶之一，可通过催化脂肪酸β-氧化，参与脂肪酸降解及延伸，是脂代谢过程中一个重要调控因子。Guo等[5]研究报道,直肠癌患者中ACAA2表达高者预后更好。近年来，白屈菜的药理作用越来越多的受到国内外学者的关注，对白屈菜中抗癌活性成分开展了一系列研究，其主要的有效成分为异喹啉生物碱以及一些非生物碱类成分，具有抗癌作用的活性成分为白屈菜生物碱类化合物，包括血根碱、白屈菜红碱、白屈菜碱等[6]。多项研究表明血根碱有抑制肿瘤生长的作用：Ma等[7]报道血根碱作用于Shh-Gli-Nanog pathway通路，抑制胰腺癌干细胞的增殖；Wei等[8]报道血根碱通过上调Fas相关因子1抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。因此，从中草医药资源中挖掘新型抗肿瘤药物，有望成为浆液性卵巢癌中草药抗肿瘤药物的重要靶点。本研究基于公共数据库中肿瘤信息，探讨ACAA2在浆液性卵巢癌中的表达及其预后关系，并分析血根碱对ACAA2基因表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/)收集提取数据

根据如下筛选条件在数据库中进行设定，用来筛选和提取所需的数据信息，设定具体筛选条件如下：1) Gene:ACAA2；2)Analysis Type: Differential Analysis，CancervsCancer Analysis，CancervsNormal Analysis; 3)Cancer Type: Ovarian Cancer；4)Sample Type: Clinical Specimen; 5)Data Type: mRNA；6)临界值设定条件(P<0.05, fold change>2, gene rank=top 10%)。设定研究结果采用箱状图展示。

1.2 Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/)分析患者生存周期

筛选条件如下：①“Cancer: Ovarian Cancer”；②“Gene:ACAA2”；③“Survival: OS”。

1.3 主要试剂及仪器

本课题实验中所应用的人浆液性卵巢癌细胞株SKOV3，购自中科院昆明动物研究所；血根碱(批号:20150607，纯度>98%，分子式:C20H14NO4)，购自上海融禾医药科技有限公司；Affymetrix人全基因单通道表达谱芯片，购自上海吉凯基因化学技术有限公司；超净工作台，SPEG AIR TECH，购自苏州净化设备厂；倒置相差荧光显微镜，DMIL LED，购自徕卡显微系统(上海)贸易有限公司；冷冻离心机，D-37520，购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；恒温振荡器，TS-211B，购自上海天呈实验器材制造有限公司；恒温培养箱，SI6R-2，购自美国Shellab公司。

1.4 人浆液性卵巢癌细胞株SKOV3培养

使用含10%标准胎牛血清和双抗的RPMI-1640细胞培养液，置于恒温培养箱中(设定培养条件：温度37.0 ℃、浓度5%CO2、湿度95%)。细胞长满培养瓶底面积八九成(贴壁率80%～90%)，经过胰酶消化、传代、收集、离心，筛选对数生长期细胞冻存。

1.5 应用基因芯片检测血根碱引起的差异表达基因

取对数生长期的浆液性卵巢癌SKOV3细胞，将细胞密度调整为1×105/mL，每孔500 μL，分别接种于12孔培养板中，划分血根碱组及对照实验组，每组3个复孔。6小时后于血根碱组加入含2.0 μmol/L血根碱培养液，对照组中则加生理盐水； 48小时后应用TRIzol法提取细胞样品中总RNA。使用Nanodrop ND-1000 UV进行质检；根据RNeasy MiNi Protocol，使用QLAG-ENR Neasy®Kit提取纯化总RNA。应用Affymetrix人全基因单通道表达谱芯片，由上海吉凯生物技术有限公司进行实验检测，进行归一化整理，归一化实验数据并行差异表达基因分析，以上调及下调2倍作为差异基因标准(|logFC|≥2，FDR<0.05，P<0.05)。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 ACAA2基因在人卵巢癌组织中的表达

自Oncomine数据库提取数据显示，自2004年开始，共有9项研究涉及ACAA2基因在浆液性卵巢癌组织和正常组织中的表达，共有1 569个样本，文章分别发表于Br J Cancer、Cancer Res、Clin Cancer Res、Cancer Sci，并有1 168个来自TCGA数据库(美国癌症与肿瘤基因组图谱)的样本。在Oncomine数据库中对这9项研究结果进行统计分析发现，与正常组相比，ACAA2基因在卵巢癌组织中表达显著降低(P=0.028) (图1)。

图1ACAA2在Oncomine数据库中卵巢癌中的表达

Figure 1.ACAA2Gene Expression in Ovarian Cancer in Studies Identified in Oncomine

2.2 不同数据集中ACAA2基因在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达

Oncomine数据库中有9项关于ACAA2基因卵巢肿瘤中表达水平的研究在Bonome等[9]、Hendrix等[10]、Lu等[11]、Yoshihara等[12]及TCGA数据集5项涉及浆液性卵巢癌的研究中，ACAA2在浆液性卵巢癌中的表达量均显著低于正常卵巢组织(P均<0.05)(图2)。

图2 Oncomine数据库中ACAA2在不同卵巢癌研究芯片中的表达(P<0.05)

Figure 2.ACAA2Gene Expression in Different Ovarian Cancer Studies from Oncomine (P<0.05)

2.3 ACAA2水平与卵巢癌病患预后的关系

Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示：ACAA2表达高的卵巢癌患者总生存率高于表达低者(P<0.05)(图3)。

图3ACAA2水平与卵巢癌患者总体生存率之间的关系

Figure 3. Relationship betweenACAA2Levels and Overall Survival of Ovarian Cancer Patients

2.4 血根碱对卵巢癌细胞ACAA2基因表达丰度的影响

基因芯片检测血根碱作用于卵巢癌SKOV3细胞后的基因表达谱，ACAA2为其中一个差异表达基因，血根碱处理后ACAA2水平显著增高(P<0.001，FDR=9.22×10-7，|logFC|=3.15)(图4)。

图4 血根碱对卵巢癌SKOV3细胞ACAA2基因表达的影响(注：与对照组比较，***P<0.001)

Figure 4. Effect of Sanguinarine onACAA2Gene Expression in SKOV3 Ovarian Carcinoma Cells (Sanguinarine GroupvsControl Group,***P<0.001)

3 讨 论

近年来，越来越多研究证实，脂质代谢与胶质母细胞瘤[13]、乳腺癌[14]、肺癌[15]、直肠癌[16]及胃癌[17]等多种肿瘤的发生发展密切相关，脂肪生成增加几乎是所有癌细胞的共性，大部分产生的脂肪都在细胞增殖中用于细胞膜的构建[18-19]。Kim等[20]提出卵巢癌恶性腹水中胆固醇升高，其机制是通过上调胆固醇受体LXR ɑ/β及药物外排泵蛋白(ABCG2、MDR1)的表达来增加对PAC化疗方案(包括顺铂DDP、阿霉素ADM及环磷酰胺CTX)的敏感性。Schafer等[21]首次证明了脂肪酸氧化对肿瘤细胞代谢应激状态下的生存起着至关重要的作用。参与脂肪酸合成过程中的关键酶，如三磷酸腺苷-柠檬酸裂解酶、脂肪酸合酶以及乙酰辅酶A羧化酶在多种恶性肿瘤中表达活性增加[22]，并且Qiu等[23]的研究表明膳食脂肪摄入及脂肪酸膳食与卵巢癌发生密切相关。

ACAA2是脂肪酸β-氧化途径中的关键酶，参与体外脂肪细胞分化。ACAA2分布在线粒体中，脂肪酸在进行β-氧化时产生的乙酰辅酶A，在ACAA2作用下催化缩合进入三羧酸循环氧化释放维持细胞活性所需的能量，参与脂肪酸代谢、调节线粒体细胞信号转导、细胞凋亡信号等，为参与脂类代谢的关键基因。多位学者研究认为，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)通过ACAA2等关键基因作用于细胞脂肪酸摄取、线粒体脂肪酸氧化等途径参与脂质代谢，并提出ACAA2可能通过PPAR信号通路参与脂代谢[24-25]。本研究通过挖掘并分析Oncomine数据库中收录的卵巢癌基因表达谱数据，发现ACAA2基因在浆液性卵巢癌组织中的表达明显低于正常卵巢组织。Kaplan-Meier Plotter数据库分析生存数据发现，高表达患者的预后更好，推测ACAA2基因在浆液性卵巢癌中可能发挥抑癌基因的作用，并主要通过脂肪酸β-氧化途径参与脂肪细胞的分化而发挥作用的。

中草药提取物的抗癌作用历史悠久，如紫杉醇、长春新碱和喜树碱等已广泛用于恶性肿瘤的治疗[26]。近年来筛选以天然成为为主的有效且毒副作用小的中草药抗癌药物,并对具有抗癌活性的有效成分进行深入研究已成为抗肿瘤药物开发领域的热点之一。白屈菜ChelidoniummajusL，最早记载于《救荒本草》用作镇痛药，也有记载白屈菜用于胃癌、皮肤癌、肺结核以及皮肤脓疮和虫蛇咬伤等的治疗[27]。目前白屈菜仍广泛用与我国的多种方剂中，如天蟾胶囊、理肺止咳胶囊方、辅助肺癌化疗的中药制剂方[28]。乌克兰应用白屈菜提取白屈菜生物碱硫代磷酸复合物UKRAIN进行胰腺癌的治疗,取得良好疗效[29]。血根碱为白屈菜主要成分之一，多项研究均证实血根碱可抑制胰腺癌及非小细胞肺癌[7-8]。本课题组在前期研究中也证实，血根碱可以抑制卵巢癌、耐药卵巢癌细胞增殖及转移，并有诱导卵巢癌细胞凋亡的作用[30-31]。为探讨ACAA2在卵巢癌治疗中的靶点作用，我们团队通过人全基因组表达谱芯片检测了血根碱作用于卵巢癌细胞株后的基因表达改变。基因芯片检测共获1 185个差异基因，ACAA2为其中之一，并且血根碱可显着上调ACAA2基因表达丰度，这提示ACAA2可能为血根碱的一个靶基因，血根碱通过上调ACAA2而表达发挥抑制卵巢癌细胞增殖的作用。

综上所述，通过Oncomine数据库及Kaplan-Meier Plotter数据库生存分析软件进行卵巢癌中ACAA2相关信息的挖掘，我们发现ACAA2基因在浆液性卵巢癌组织中表达降低，且其表达水平与卵巢癌预后呈正相关。细胞学试验初步证实，血根碱可能通过上调其表达抑制卵巢癌细胞增殖，但后期仍需进一步体外实验验证，同时深入探讨其作用机理，为卵巢癌的诊治提供新视角。

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