3 种方法检测围产期孕妇阴道分泌物B 群链球菌的效果分析

陶娅琳 毛德超 王宁 王星花 马丽娟 雷志辉 代娇

作者单位：655000 云南曲靖，曲靖市第二人民医院医学检验科（陶娅琳、毛德超、王宁、王星花、马丽娟、雷志辉）

655000 云南曲靖，曲靖市医学高等专科学校（代娇）

B 群链球菌（group B streptococcus，GBS）俗称无乳链球菌,属于兼性厌氧革兰阳性（G+）球菌，是β溶血性链球菌属最重要的条件致病菌之一，正常情况下广泛定植于阴道和直肠部位。从1938 年Fry首次报道GBS 可引起人类感染导致死亡，该菌就被证实为人类的致病菌［1］。随后的研究显示，GBS 属于条件致病菌，当机体抵抗力降低或微生态平衡遭到破坏时可发生机会性感染［2-3］，如在健康妇女阴道内存在多种正常微生物菌落，GBS 不作为致病菌处理。但对于妊娠中晚期孕妇，由于内分泌的变化，雌激素和孕激素水平升高，使得局部细胞免疫功能下降，同时阴道内糖原增加，为GBS 提供了良好的生长环境，可引起围产期孕产妇感染导致胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、胎儿窘迫、早产、产后出血、产褥感染等，导致不良妊娠结局［4-5］。并且，GBS 具有一定的母婴垂直感染风险，若新生儿垂直感染该菌可增加其围产期死亡风险［6］。因此，准确而快速地为临床诊断提供围产期孕产妇的GBS 感染情况并采取预防措施极其重要，对于减少GBS 感染引起的不良妊娠结局意义重大［7］。本研究采用不同方法对围产期孕产妇GBS 带菌率进行筛查，比较不同方法的优缺点，旨在为曲靖地区提供较合适的检测方法。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集2019 年1 —8 月自愿就诊于本院妇产科的围产期孕妇（孕35～37 周）送检的1 088 份标本。

1.2 仪器与试剂 梅里埃VITEK2-Compact 型自动细菌鉴定仪，美国ABI7300 聚合酶链反应（PCR）扩增仪，二氧化碳（CO2）培养箱，梅里埃配套G+球菌鉴定卡（GP），5%绵羊血琼脂平板（郑州安图生物工程股份有限公司提供），GBS 显色培养基，GBS 核酸提取试剂盒（天津达安集团股份有限公司提供）。

1.3 质量控制（质控）菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希菌（ATCC25922）、铅黄肠球菌（ATCC700327）、无乳链球菌（ATCC12386）。

1.4 检测方法

1.4.1 标本收集 本研究送检的标本均由产科接诊医生采集，以无菌棉签轻轻旋转采集就诊孕妇阴道下1/3 处分泌物，同时采集2 份，立即送检。本院检验科接收标本后30 min 内进行细菌培养接种，另一份标本加入生理盐水于-70 ℃冰箱保存，以备PCR检测。

1.4.2 GBS 检测

1.4.2.1 一般细菌培养法 将标本均匀涂抹于血琼脂平板，采用分期划线法接种标本后，平板于35～37 ℃、5%～10% CO2培养箱中培养过夜，次日观察筛选β 溶血、革兰氏染色为阳性的链球菌进行分纯培养，同时挑取单个菌落进行GBS 鉴定试验（CAMP 试验）和杆菌肽试验，孵育18～24 h 后选取CAMP 试验阳性（出现箭头状β 溶血现象）、杆菌肽阴性的分纯菌株，配制0.5 麦氏单位菌悬液，插入鉴定卡置入VITEK2-Compact 自动细菌鉴定仪进一步鉴定，以金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希菌（ATCC25922）、铅黄肠球菌（ATCC700327）、无乳链球菌（ATCC12386）作为标准菌株同时进行实验，次日记录结果。

1.4.2.2 GBS 显色培养法 接种方法同一般细菌培养法，平板于35～37 ℃、5%～10% CO2培养箱中培养8～24 h，观察培养平板上的菌落显色情况，挑取红色菌落分纯，次日进行上机鉴定（同一般细菌培养法），记录结果。

1.4.2.3 实时荧光PCR 对试剂盒阳性质控品（浓度为1×106拷贝/mL）进行倍比稀释，制备浓度为1×103、1×104、1×105、1×106拷贝/mL 的4 个标准品，按照试剂盒说明书进行DNA 提取、扩增及结果判读，将标准菌株金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希菌（ATCC25922）、无乳链球菌（ATCC12386）阴阳性质控与标本同时提取，试验结束后记录结果。

1.5 伦理学 本研究符合医学伦理学标准，经本院伦理批准（审批号：20191020），所有对患者进行的检测均获得过患者或家属的知情同意。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件对数据进行分析，计数资料以例或百分比表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 种方法筛查GBS 感染的结果比较 1 088 份围产期孕妇阴道分泌物标本中，一般细菌培养法检出GBS 阳性55 份（阳性率5.06%），GBS 显色培养法检出GBS 阳性62 份（阳性率5.70%），实时荧光PCR 检出GBS 阳性78 份（阳性率为7.17%）。实时荧光PCR 阳性率明显高于一般细菌培养法，差异有统计学意义（χ2＝4.24，P＝0.036），其余方法比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 3 种方法筛查围产期孕妇GBS 感染阳性率比较

2.2 3 种检测方法评价 以一般细菌培养法作为参考标准［8］，分别计算其余两种方法的敏感度、特异度和准确度，GBS 显色培养法分别为100.0%、99.3%、99.4%，实时荧光PCR 分别为96.4%、97.6%、97.5%，两种方法比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 GBS 显色法和实时荧光PCR 评价指标

2.3 3种方法检测时长比较 一般细菌培养法和GBS 显色培养法所需时长为24～36 h，耗时较长；实时荧光PCR 检测法需要4～6 h，耗时较短。

3 讨论

目前，GBS 是国际公认的导致严重围产期感染的重要致病菌，据报道，GBS 在西方国家的围产期感染中居首位［9-10］，感染率在5%～35%不等［11］。孕产妇GBS 感染可诱发产褥感染、宫内感染、泌尿系统感染等多种疾病，影响产妇产后恢复，同时约40%～70% GBS 感染的产妇在分娩过程中会通过垂直传播感染新生儿，引起新生儿菌血症、新生儿肺炎、新生儿脑膜炎等严重感染。近年来，GBS 感染引起广泛重视，随着对疾病研究的不断深入，发现母体检测GBS为阳性者，新生儿发生感染的机会较低，仅为1%～3%，一旦发生感染，病死率约为5%［12］。西方国家对GBS 非常重视,美国疾病预防控制中心在2010 年已修订了对于围产期GBS 的筛查、防治指南［13］，有效减少了围产期GBS 感染的发生以及产生的危害。

我国对GBS 感染的研究起步较晚［14］，有部分学者研究显示，北京地区孕妇的GBS 带菌率为17.6%［15］，桂林地区孕妇检出率为7.5%［16］，长沙地区孕妇感染率为11.25%［17］，上海地区为3.7%［18］，南京地区为4.2%［19］等，本研究检测出的GBS 感染率为5.06%（一般细菌培养法），提示GBS 感染存在地区差异，可能还受人群、年龄、教育程度、检测技术等因素的影响。因此，还需加强对围产期孕产妇GBS 的筛查，从而尽早给予干预治疗，以免造成不良的妊娠结局。目前，我国约90%的围产期孕妇在产检时已接受了GBS 感染的筛查，但仍然有部分农村地区的孕产妇因知识不足、意识性不强、经济条件落后等原因未接受GBS 的常规筛查。为进一步提高人口出生质量，应该将GBS 的筛查技术全覆盖至基层医疗单位。

对于GBS 的检测，不同地区、不同医院采用的检测技术不同。本研究主要采用标准方法即一般细菌培养法，但其在开展的3 种方法中检出阳性率最低，GBS 培养对营养要求高，菌株在血平板上生长易受多种污染菌的干扰和抑制。采用GBS 显色培养法阳性率较一般细菌培养法有提高，显色培养基选择为鉴别培养基，可使溶血性的GBS 菌株产生类胡萝卜样色素（此法不能检出不具有溶血性的GBS菌株），在培养基上出现橘红色、砖红色或紫红色的颜色变化。GBS显色培养法与一般细菌培养法相比，敏感度、特异度和准确度分别为100.0%、99.4%、99.4%，该方法操作简单，仅需根据培养基颜色变化判读结果，成本较低，适合作为孕妇GBS 阳性率筛查和辅助诊疗的常规方法进行推广。实时荧光PCR检测技术是将DNA 样本在体外扩增获得较多的特定DNA 片段，利用荧光标记探针检测样本中GBS特定基因，其优点在于可检测到少数不溶血菌株和死亡的菌株，检出阳性率明显高于一般细菌培养法，敏感度、特异度和准确度分别为96.4%、97.6%、97.5%，与文献报道［20-21］基本一致，且仅耗时4～6 h，大大缩短了检测时限，但该方法对人员操作技术要求较高，试剂和仪器成本昂贵，且检出的阳性菌株不能直接用于药敏试验，对于有治疗需求的患者可能导致治疗时间延长。因此，该方法更适合于为临床提供准确、快速的诊断依据，对于经济不发达地区可能增加患者的经济负担。

综上所述，一般细菌培养法和实时荧光PCR 各有优缺点，本研究显示，PCR 检测法的阳性率高于另外两种方法，符合从传统微生物学技术过渡至分子生物学的发展趋势，但该技术尚处于发展初期阶段，其对成本、技术、人员、设备等的要求较高，临床推广有一定的困难［22］，还未能普及至基层医院，而GBS 显色培养法阳性率与实时荧光PCR 阳性率无显著差异，敏感度和准确度均较高，虽检测时限稍长，但能同时为阳性标本提供抗菌药物使用依据，且成本较低，较适合基层医院用于进行GBS 的常规筛查和防治，但我们认为GBS 检测技术的发展应向经济、简便、快捷、高通量、高准确性的方向转变，以满足临床快速筛查的需要，对此临床可根据感染患者的具体情况和接受程度选择合适的检测方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突