骨髓间充质干细胞关节腔内注射对膝骨性关节炎炎症因子表达的影响

姚金龙 吴睿哲 梁晓辉 孙绍裘 冯海波

作者单位：410208 湖南长沙，湖南中医药大学（姚金龙、吴睿哲）

410000 湖南长沙，湖南中医药大学第二附属医院骨伤四科（梁晓辉、孙绍裘、冯海波）

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年人群中常见的慢性退行性疾病，随着社会老龄化，KOA 的发病率呈逐年上升趋势，已成为中老年人跛行甚至致残的重要原因［1］。KOA 的临床常见症状以关节软骨损害为特征，病变常累及软骨、滑膜以及关节周围软组织［2］。因此保护患者膝关节软骨，延长膝关节使用寿命，从而提高中老年患者生活质量，是当前亟需解决的课题。透明质酸是人体自身存在的物质，具有良好的生物相容性，以透明质酸为支架，混合骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）构成可利用的三维支架行关节腔内注射，在避免关节损伤的同时，可以起到抗炎及修复软骨的作用，具有其特有的优势。本研究旨在探讨BMSCs 关节腔内注射对KOA 炎症因子表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 由湖南中医药大学动物实验中心购得成年健康雄性新西兰白兔30 只，体质量2.5～3.0 kg，编号后按随机数字表法分组，最终纳入动物数分别为生理盐水组8 只、玻璃酸钠组9 只、玻璃酸钠混合干细胞组9 只。饲养1 周，观察各组动物无明显疾患并确保健康。本实验过程中对动物的处置方法符合动物伦理学标准，并经本单位伦理批准（审批号：20200519）。

1.2 实验细胞及试剂

1.2.1 自体BMSCs 的制备 将模型兔分别穿刺双侧股骨大转子骨髓腔，可得4 mL 骨髓，以全血培养法培养纯化原代自体BMSCs。待细胞长至铺满瓶底90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1：3 传代培养。以后各代均以此密度传代扩增。原代培养细胞记为P0，此后顺次为P1、P2 等。诱导液由营养培养基F-12、20%胎牛血清、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）15 μg/L、胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）10 μL/mL、维生素C 80 mg/L、地塞米松50 mg/L 组成。消化、离心收集第3 代BMSCs，再加入诱导液和透明质酸（haluronic acid，HA）制成6×108/mL 的细胞悬液。在24 孔板中每孔接种1 滴（每滴10 μL），形成微小三维细胞球团结构，不加入诱导液在培养箱静置2～3 h后，每孔轻轻加入适量诱导液，避免吹散细胞，置于细胞培养箱继续培养，每日更换2/3 量培养液。培养第14 天，取出细胞团用0.25%胰蛋白酶消化，轻轻吹散后洗涤离心，留取沉淀的已分化细胞备用。

1.2.2 试剂 玻璃酸钠注射液（山东博士伦福瑞达制药有限公司，国药准字H20067379）和生理盐水（中国大冢制药有限公司，产品批号9J74B2）均购于湖南中医药大学第二附属医院。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备及处理 通过手术切断兔膝关节前交叉韧带和内侧副韧带复制KOA 模型。具体方法：采用化学纯氨基甲酸乙酯（乌拉坦）麻醉，用0.9%盐水将其配制成25%的溶液，按1 g/kg 体质量（4 mL/kg 体质量）耳缘静脉注射。麻醉满意后，剪除右后肢膝关节周围毛发，常规消毒，髌旁内侧切口长约3 cm，切开关节囊，将髌骨向外翻转，切断前交叉韧带和内侧副韧带，止血，缝合关节囊及皮肤，术后每日1 次给予每只动物肌内注射400 kU 青霉素进行抗感染治疗，共3 d。1 周后待伤口愈合良好，开始强迫兔活动膝关节，每次0.5 h，每日2 次，4 周后KOA 模型复制成功。

1.3.2 药物干预 术后每周经皮关节穿刺并注射药物，生理盐水组给予膝关节腔注射生理盐水（每只0.3 mL），玻璃酸钠混合干细胞组给予膝关节腔内注射玻璃酸钠混合干细胞（每只0.3 mL）、玻璃酸钠组给予关节腔内注射玻璃酸钠注射液（每只0.3 mL），每周1 次，持续4 周；对侧肢体（左后肢）不予干预。

1.3.3 标本采集及处理

1.3.3.1 血清样本 4 周后各组白兔禁食12 h，取颈外静脉血8 mL，使用低温高速离心机3 000 r/min 离心10 min，提取血清。

1.3.3.2 滑膜组织样本 4 周后过量麻醉处死兔，每只依次打开关节腔用锐刀切取内侧滑膜和股骨内髁下面全层关节软骨，留取标本备检。

1.3.4 炎症因子水平测定 采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清及滑膜组织中白细胞介素（interleukin，IL）-1β和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

玻璃酸钠组和玻璃酸钠混合干细胞组兔血清及滑膜组织中IL-1β 和TNF-α 水平均明显低于生理盐水组；玻璃酸钠混合干细胞组血清及滑膜组织中IL-1β、TNF-α 水平均明显低于玻璃酸钠组（均P＜0.05）。见表1。

表1 不同干预方式3 组KOA 模型兔血清及滑膜组织IL-1β、TNF-α 含量的比较（）

表1 不同干预方式3 组KOA 模型兔血清及滑膜组织IL-1β、TNF-α 含量的比较（）

注：KOA 为膝骨性关节炎，IL-1β 为白细胞介素-1β，TNF-α为肿瘤坏死因子-α；与生理盐水组比较；与玻璃酸钠组比较，bP＜0.05

3 讨论

KOA 属于临床常见骨科疾病，主要以关节软骨慢性退行性改变为临床病理特征，目前其治疗关键仍为减缓软骨退变［3］。KOA 晚期手术治疗费用高，并发症多，手术风险大。软骨细胞的新生目前仍是骨科领域面临的难题，软骨细胞本身迁徙能力不高，增生能力差，再生能力也非常低，故软骨损伤后很难自体恢复。另外软骨细胞取材困难，来源有限，故体外培养困难，因此难以成为有效的种子细胞［4］。

BMSCs 是一类来源于中胚层具有多向分化潜能的干细胞。Caplan 等［5］及Lodi 等［6］认为BMSCs注射以及移植方案正在成为一种用于软骨修复的有效治疗方法，主要由于其具有较强的分化成各种结缔组织（包括软骨、骨、脂肪、肌腱、韧带等）的能力。近年来对BMSCs 的研究逐渐深入，BMSCs 存在于自体骨髓中，具有取材方便、来源广泛、无免疫排斥反应并且性状稳定、易于保存等优势［7］。这促使BMSCs 用于软骨修复变为可能。其中在动物实验中，Caplan 等［8］用适量的BMSCs 干预兔膝关节的股骨髁全层软骨损伤模型，发现关节软骨有不同程度的修复。Mason 等［9］利用腺病毒转染BMP27基因到兔BMSCs，促进BMSCs 的表达，在修复兔膝关节软骨缺损模型中有效改善软骨质量并缩短软骨修复时间。而Yoo 等［10］分离骨髓中的BMSCs，体外培养导入基因，而后将这些经过遗传修饰的细胞与软骨诱导因子一起输回体内，发现靶细胞和生物活性因子到达受损的关节软骨处并使关节软骨逐渐恢复功能。张钟元等［11］也发现关节镜清理联合自体BMSCs 移植能有效促进早期KOA 关节软骨的修复，延缓KOA 病程的进展。

促炎细胞因子也称前炎性细胞因子，具有较强的生物学效应，主要由免疫细胞生成，可介导多种免疫反应。而膝关节内促炎细胞因子与抗炎细胞因子保持动态平衡，共同维持关节软骨的生理代谢。目前发现的KOA 促炎细胞因子主要包括IL-1β、TNF-α、IL-15、IL-6、IL-17 及IL-18 等。其中IL-1β和TNF-α 在KOA 发病进程中可通过丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信号通路调控，从而释放炎症介质，引发关节软骨退变［12］。基于以上研究，推断BMSCs 保护软骨可能与其抑制促炎细胞因子有关。

本实验结果表明，BMSCs 关节腔内注射可减少KOA 模型兔血清和滑膜组织中IL-1β 和TNF-α的表达，并与玻璃酸钠互为协同作用，从而保护关节软骨，这为临床治疗KOA 提供了实验依据，但其具体干预机制尚有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突