出生后小鼠耳蜗发育过程中高迁移率族蛋白B1的表达分布

刘文静丁小琼王旭东杨军

1东南大学附属中大医院耳鼻咽喉头颈外科(南京210009)

2皖南医学院弋矶山医院耳鼻咽喉头颈外科(芜湖241000)

3上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻咽喉头颈外科(上海200082)

上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室(上海200029)

上海交通大学医学院耳科学研究所 (上海200029)

高迁移率族蛋白(High Mobility Group，HMG)是一类进化高度保守的非组蛋白，主要分布在真核细胞的胞核内。根据HMG分子量大小、结构相似性和DNA结合特性，将其分为HMGA、HMGB和HMGN家族[1]，其中HMGB家族表达最为丰富。HMGB家族又包括HMGB1、HMGB2及HMGB3。在HMGB家族3个成员中，HMGB1研究最多最深入。HMGB1在胞核中主要与DNA结合，参与细胞复制、DNA的重组、基因转录等生命活动[2]。HMGB1不仅在肿瘤、炎症、创伤等疾病的发病机制中起重要作用[3-5]，也可作为转录因子及生长因子，参与多种细胞分化及增殖过程，例如脊髓细胞及骨骼肌细胞再生、内皮细胞增殖及神经元分化等[6-9]。研究发现，HMGB1在内耳组织表达的变化与阿卡米星及顺铂对大鼠的耳毒性作用密切相关[10,11]。方佳等[12]报道HMGB1表达分布在正常成年小鼠耳蜗中Corti器感觉毛细胞、Deiters细胞及螺旋神经元，这表明HMGB1可能在听觉功能中发挥十分重要的作用。有研究报道HMGA家族成员之一的HMGA2在发育中小鼠耳蜗呈时空特异性表达，并与耳蜗发育密切关联[13]，HMGB1在正常小鼠耳蜗发育过程中是否也有类似作用，目前尚无文献报道。为此，本研究拟通过观察HMGB1在出生后不同鼠龄小鼠耳蜗中的时空表达分布，分析其在小鼠耳蜗发育过程中可能发挥的作用，从而为耳蜗发育机制的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

挑选10周龄健康BALB/c小鼠8对作为种鼠，雄鼠体重25±2g，雌鼠体重20±2g，每对种鼠提供1个年龄段的新生鼠。按照出生后的天数将小鼠分为出生后1天(P1)、7天(P7)、12天(P12)、17天(P17)、21天(P21)以及成年小鼠(＞2月龄)共6组，每组6只。

1.2 实验方法

1.2.1 标本制备

将小鼠用预冷4%多聚甲醛经心脏灌注固定，迅速断头，置入新鲜配制的4%多聚甲醛溶液，在解剖显微镜(Leica，德国)下分离耳蜗组织，开放圆窗及卵圆窗，蜗顶打孔，玻璃吸管经蜗尖打孔处行耳蜗内灌注，室温后固定1h。P7及P7以上鼠龄的耳蜗置于10%EDTA 4°C酌情脱钙，15%蔗糖溶液4°C浸泡3h，后放入30%蔗糖溶液4°C浸泡8h。滤纸吸干耳蜗表面液体，OCT(optimal cutting temperature)包埋剂4°C包埋3h，沿耳蜗蜗轴水平作冰冻切片(Leica恒冷冰冻切片机)，片厚8μm。

1.2.2 双重免疫荧光染色

耳蜗冰冻切片室温晾干，PBS洗OCT胶；0.3%Triton X-100/10%驴血清溶液室温通透封闭30 min，PBS漂洗，滴加抗HMGB1兔多克隆抗体(1:200，Abcam公司)以及抗Sox2山羊单克隆抗体(1:200，Santa Cruz Biochemicals公司)4℃孵育过夜，用PBS代替一抗作空白对照，PBS漂洗，加抗兔Alexa Fluor 546(1:200，碧云天公司)和 IFKine™ Green Donkey Anti-Goat IgG(1:200，博士德公司)室温孵育2h，PBS漂洗，载玻片上滴加DAPI(1:800，碧云天公司)后封片。激光共聚焦显微镜(Leica，德国)下观察、拍照，激发波长分别为561nm、488nm以及405nm。P1、P7、P12、P21和成年期5个年龄段每只小鼠随机选取1张耳蜗冰冻切片激光共聚焦成像，然后用图像分析系统(Image-Pro Plus 6.0)分别在每张图片Corti器的内、外毛细胞和Deiter cells以及螺旋神经元和神经胶质细胞区域共选取5个不同的细胞，软件检测HMGB1在5个不同的细胞阳性染色的平均光密度值(Average optical densities，AOD)，最后做统计学分析。

1.2.3 统计分析

GraphPad Prism 6.0做图，所有实验数据采用SPSS 25.0（SPSS Inc.,美国）统计软件行单因素方差分析(one-way ANOVA)，数据以平均值±标准误(±SEM)表示，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 耳蜗侧壁HMGB1的表达

新生小鼠耳蜗侧壁尚未发育成熟，构成血管纹的3层细胞未完全形成。本研究结果发现，HMGB1在耳蜗侧壁胞核的表达自出生即出现(图1A)。P7组，血管纹3层细胞清晰可见，细胞间隙扩大。HMGB1表达在血管纹中央区域的血管，血管纹缘细胞、中间细胞和连接螺旋韧带的基底细胞。HMGB1胞核表达也出现在螺旋韧带纤维细胞与螺旋韧带内血管(图1B)。P12组，血管纹及螺旋韧带基本发育成熟，HMGB1的表达继续在血管纹、螺旋韧带以及耳蜗侧壁血管(图1C-D)。在P17和P21组，HMGB1在耳蜗侧壁的表达分布与P12组基本一致(图1E-G)，并持续至成年期(图 1H-I)。

图1 耳蜗侧壁HMGB1的表达。A：P1组，HMGB1胞核表达在血管纹、螺旋韧带和外凹细胞。B-I：从P7至成年期，血管纹3层细胞、螺旋韧带、血管纹以及螺旋韧带内的血管（三角形）均有HMGB1的表达。m：血管纹缘细胞；i：中间细胞；b：基底细胞；os：外凹细胞；SL：螺旋韧带；SV：血管纹。Fig.1 The expression of HMGB1 in the cochlear lateral wall.A:At P1,nuclear HMGB1 staining was located in the stria vascularis and spiral ligament and outer sulcus.B-I:From P7 to adult,HMGB1 was expressed in the stria vascularis,blood vessels(arrowhead)of the stria vascularis and the spiral ligament.m:strial marginal cells;i:intermediate cells;b:basal cells;os,outer sulcus;SL:spiral ligament;SV:stria vascularis.

2.2 听觉上皮HMGB1的表达

在P1和P7组，HMGB1除了表达在Corti器中的内毛细胞和外毛细胞外，Deiters细胞、柱细胞、Hensen细胞以及大上皮嵴也出现HMGB1的表达，并与支持细胞标记蛋白Sox2共表达(图2A-F)。另外，衬覆基底膜鼓阶面的鼓室边缘细胞可见HMGB1的表达。从P7起，HMGB1开始表达在内毛细胞突触区的神经纤维末梢(图2D)。P12组大上皮嵴细胞的数量及形态出现变化，大上皮嵴“嵴突”消失，而内凹细胞明显可见。HMGB1与Sox2共表达在大上皮嵴未完全退化的残留柱状细胞(图2G-I)。随着P17组大上皮嵴完全退化解体，HMGB1与Sox2在大上皮嵴的共表达也消失(图3A-C)。P21和成年期，HMGB1与Sox2的表达分布未见明显改变，鼓室边缘细胞仍有HMGB1的胞核表达(图 3D-I)。

图2 P1、P7和P12组听觉上皮HMGB1及Sox2的表达。A、D、G：HMGB1表达在大上皮嵴、Corti器毛细胞、柱细胞、Deiters细胞以及Hensen细胞。鼓室边缘细胞及内毛细胞基底部的神经纤维末梢（箭头）也有HMGB1的表达。P12组，HMGB1在内凹细胞的表达显著。B、E、H：Sox2表达在大上皮嵴、Corti器支持细胞。C、F、I为DAPI、HMGB1和Sox2的叠加成像。ger：大上皮嵴；ihc：内毛细胞；ohc：外毛细胞；dc：Deiters细胞；pc：柱细胞；hc：Hensen细胞；tbc：鼓室边缘细胞；is：内凹细胞。Fig.2 The expression of HMGB1 and Sox2 in the auditory epithelium at P1,P7 and P12.A、D、G:HMGB1 was expressed in the greater epithelial ridge,the inner and outer hair cells of the organ of Corti,pillar cells,Deiters cells,Hensen’s cells,the tympanic border cells and nerve fibers(arrows).At P12,the expression of HMGB1 in the inner sulcus cells was visible.B、E、H:Sox2 immunostaining was present in the greater epithelial ridge cells and supporting cells of the organ of Corti,C、F、I represented the merged images.ger,greater epithelial ridge;ihc,inner hair cells;ohc,outer hair cells;pc,pillar cells;dc,Deiters cells;hc,Hensen’s cells;tbc,tympanic border cells;is,inner sulcus cells.

图3P17、P21和成年组听觉上皮HMGB1及Sox2的表达。A、D、G：各组均可见HMGB1表达在Corti器内指细胞、毛细胞、Deiters细胞、Hensen细胞、鼓室边缘细胞及外周神经纤维末梢（箭头）。B、E、H：各组均可见Sox2表达在Corti器支持细胞。C、F、I为DAPI、HMGB1和Sox2的叠加成像。ipc：内指细胞；ihc：内毛细胞；ohc：外毛细胞；dc：Deiters细胞；pc：柱细胞；hc：Hensen细胞；tbc：鼓室边缘细胞；is：内凹细胞。Fig.3 The expression of HMGB1 and Sox2 in the auditory epithelium at P17,P21 and adult.A、D、G:HMGB1 was expressed in the inner phalangeal cells,the inner and outer hair cells,pillar cells,Deiters cells,Hensen’s cells,the tympanic border cells and peripheral nerve fibers(arrows).B、E、H:Sox2 was expressed in the supporting cells of the organ of Corti.C、F、I represented the merged images.ipc,inner phalangeal cells;ihc,inner hair cells;ohc,outer hair cells;pc,pillar cells;dc,Deiters cells;hc,Hensen’s cells;tbc,tympanic border cells;is,inner sulcus cells.

2.3 螺旋缘HMGB1的表达

HMGB1在P1组表达在小鼠耳蜗螺旋缘内齿细胞、纤维细胞及螺旋缘内血管(图4A)。P7组，内凹细胞开始形成。HMGB1表达出现在投射到骨性螺旋板的外周神经纤维及内凹细胞(图4B)。P12组至成年期，HMGB的表达继续在耳蜗外周神经纤维、螺旋缘细胞及螺旋缘内的血管(图4C-F)。

图4 螺旋缘HMGB1的表达。A：P1组，HMGB1胞核染色分布在内齿细胞和位于其下方的纤维细胞以及螺旋缘内的血管（三角形）。B：P7组，内凹细胞和骨性螺旋板的外周神经纤维（箭头）可见HMGB1的表达。C-E：P12、P21和成年组，HMGB1的表达在螺旋缘、螺旋缘内的血管以及外周神经纤维。idc:内齿细胞；sb:螺旋缘。Fig.4 HMGB1 was expressed in the spiral limbus.A:At P1,nuclear HMGB1 staining was detected in the interdental cells and fibrocytes of the spiral limbus as well as the blood vessels(arrowhead).B:At P7,HMGB1 was expressed in the inner sulcus and peripheral nerve fibers(arrows).C-E：At P12,P21 and adult,HMGB1 was sustained in the spiral limbus and the blood vessels of the spiral limbus as well as peripheral nerve fibers.idc:the interdental cells;sb:spiral limbus.

2.4 螺旋神经节区HMGB1的表达

在P1、P7组螺旋神经节区，HMGB1为胞核染色。HMGB1表达分布在螺旋神经元和其周围神经胶质细胞，HMGB1与Sox2蛋白共表达在包裹螺旋神经元的神经胶质细胞(图5A-F)。P12组，HMGB1除了表达在螺旋神经元及神经胶质细胞的胞核外，螺旋神经元胞浆亦见HMGB1的表达(图5G-I)。P17、P21和成年组螺旋神经节区，HMGB1的表达主要分布在螺旋神经元的胞核，但仍可见其在胞浆及胞核区(图 6A-I)。

2.5 免疫荧光半定量分析

P1、P7、P12、P21和成年组Corti器内毛细胞和外毛细胞HMGB1的平均光密度值无统计学差异(F=0.672、0.731，P=0.516、0.562＞0.05)。 P1、P7、P12、P21和成年组Deiters细胞HMGB1的平均光密度值分别为0.0496±0.0006、0.1017±0.0056、0.0941±0.0076、0.1020±0.0107和0.1371±0.0198，且P1组平均光密度值与P7、P12、P21和成年组相比，有显著性差异(F=4.125、P=0.017*＜0.05)(图7A)。P1、P7、P12、P21和成年组螺旋神经元和胶质细胞HMGB1的平均光密度值差异没有统计学意义(F=0.379、0.412，P=0.796、0.801＞0.05)(图7B)。

图5P1、P7和P12组螺旋神经节区HMGB1和Sox2的表达。A、D:P1和P7组，HMGB1的胞核表达在“圆形”螺旋神经元及“梭形”神经胶质细胞。G:P12组，少数螺旋神经元胞核和胞质（箭头）出现HMGB1的表达。B、E、H：各组均可见Sox2表达在神经胶质细胞。C、F、I为DAPI、HMGB1和Sox2的叠加成像。Fig.5 The expression of HMGB1 and Sox2 in the spiral ganglion area at P1,P7 and P12.A、D:HMGB1 immunostaining was detected in the round-shaped nuclei of spiral ganglion neurons and spindle-shaped glial cell nuclei at P1 and P7.G:Note some spiral ganglion neurons(arrows)exhibited cytoplasmic and nuclear HMGB1 immunolabeling at P12.B、E、H：Sox2 was expressed in the glial cell at P1,P7 and P12.G:C、F、I represented the merged images.

图6 P17、P21和成年组螺旋神经节区HMGB1和Sox2的表达。A、D、G:各组HMGB1主要表达在胞核，一些螺旋神经元胞核和胞质（箭头）可见HMGB1的表达。B、E、H：Sox2表达在神经胶质细胞。C、F、I为DAPI、HMGB1和Sox2的叠加成像。Fig.6 The expression of HMGB1 and Sox2 in the spiral ganglion area at P17,P21 and adult.HMGB1 immunoreactivity remained in the cell nuclei.Some spiral ganglion neurons(arrows)exhibited cytoplasmic and nuclear HMGB1 immunolabeling.B、E、H：Sox2 was expressed in the glial cell.C、F、I represented the merged images.

图7 HMGB1在P1、P7、P12、P21和成年组小鼠Corti器和螺旋神经节区免疫荧光平均光密度值（AOD）统计学分析(n=30，每年龄组各6只)。A、B:HMGB1在各组Corti器中内、外毛细胞及螺旋神经元和神经胶质细胞的表达均无明显差异。但在Deiters细胞，P1组与P7、P12、P21和成年组相比，HMGB1表达有显著性差异。其中*代表P＜0.05，**代表P ＜0.01。Fig.7 A,B Statistical analysis of the average optical densities of HMGB1 in the organ of Corti and spiral ganglion at P1,P7,P12,P21 and adult(n=30,divided into five groups of six mice each).A、B:There was no significant difference in the expression of HMGB1 in the inner and outer hair cells,spiral ganglion neurons and glial cells between P1 compared with P7,P12,P21 and adult(P＞0.05).There were significant differences in the average optical densities of HMGB1 in the Deiters cells between P1 with P7,P12,P21 and adult(P＜0.05).Significance of one-way ANOVA and least significant difference T test.*P ＜0.05，**P＜0.01.

3 讨论

HMGB1存在于几乎所有的真核生物细胞内，例如内皮细胞、血管平滑肌细胞、神经元和星形胶质细胞等[14-17]。本研究中，HMGB1在出生后小鼠耳蜗发育的各阶段都有表达，并广泛分布于耳蜗不同的细胞。通过分析HMGB1在出生后小鼠耳蜗不同发育阶段不同细胞中的表达，发现在不同时期的Corti器感觉毛细胞、螺旋神经元及神经胶质细胞，HMGB1的表达无明显差异。但在不同年龄段的Deiters细胞，HMGB1存在表达差异。HMGB1在这些耳蜗细胞中执行的功能目前尚不清楚。研究已证实，出生后哺乳动物的听觉感觉上皮仍具有增殖、分化的潜能[18,19]，尤其是出生后早期阶段的大上皮嵴柱状细胞和鼓室边缘细胞可始终保持一种慢循环状态，在特定条件下具备干细胞的特性和功能[20,21]。本研究结果发现，HMGB在各个阶段的鼓室边缘细胞、Corti器感觉毛细胞及支持细胞中均特异性表达。大上皮嵴是耳蜗发育过程中的一个暂态结构，在小鼠出生两周后被内凹细胞代替。Sme-ti等[13]的研究结果显示在大上皮嵴HMGA2与Sox2的共表达仅出现在胚胎发育晚期，新生小鼠的大上皮嵴细胞并无表达。研究已证实，Sox2可作为发育转录因子，对发育过程中细胞分裂与分化的维持发挥十分重要的作用[22]。Sox2已被证实参与哺乳动物的听觉上皮细胞的分化与形成过程[23]，Sox2基因敲除将导致耳蜗Corti器与大上皮嵴细胞混杂无法区分界限[24]。因此推测，HMGB1可能参与调控早期阶段听觉感觉上皮的发育与成熟过程。内淋巴电位(EP)主要通过耳蜗外侧壁分泌K+入中阶而产生[25]，EP通常在小鼠出生后第6天开始出现，在毛细胞声音转导具有极其重要的作用。螺旋缘、外凹细胞及螺旋韧带可通过参与内外淋巴液K+循环对EP的维持发挥十分重要的作用[26]。此外，耳蜗微循环在EP的形成中也起重要的作用，耳蜗微循环紊乱可导致听觉功能的障碍[27]。在出生后早期阶段的螺旋缘、耳蜗外侧壁以及外侧壁内的毛细血管均可见HMGB1的表达，提示HMGB1可能通过参与促进正常EP的产生与维持，从而对正常听觉的形成发挥作用。

本研究结果显示，HMGB1在螺旋神经元的表达呈现年龄相关性改变。在新生小鼠，HMGB1集中表达在螺旋神经元的胞核。从P12到成年组，一些螺旋神经元胞浆和胞核均有HMGB1的表达分布。在其他正常组织细胞中，HMGB1也有报道在细胞核和细胞浆内均有表达。例如大脑神经元、羊膜上皮细胞及造釉细胞等[28-30]。然而，HMGB1亚细胞定位的改变在小鼠正常发育过程中的生物学功能尚不完全清楚。有研究报道，在缺氧、营养供应不足、氧化应激等多种刺激因素作用下，HMGB1可从细胞核转位至细胞浆，参与细胞自噬、凋亡及坏死等过程[31,32]。神经元的胞核在神经组织中扮演着神经发育调节因子的角色[33]，其周围的神经胶质细胞具有支持、营养及保护的功能[34]。在螺旋神经节区的神经胶质细胞，与HMGB1共表达的Sox2已被证实具有促进螺旋神经元的生长、发育及功能维持的作用[35]，这说明HMGB1可能参与正常小鼠螺旋神经元发育过程。另外，HMGB1在听觉形成前开始表达在支配内毛细胞的外周神经纤维。已有研究报道，出生后早期的小鼠耳蜗发生轴突生长、突触形成、轴突退缩、突触重组等一些关键事件，确保螺旋神经元发出的轴突形成正确的突触连接，从而完成听觉信息准确传递[36]。这进一步说明在小鼠外周听觉神经通路发育过程中，HMGB1表达变化可能在听觉神经传递的建立起重要的作用。

综上所述，HMGB1广泛表达在不同发育阶段的小鼠耳蜗，其主要表达分布于血管纹、螺旋韧带、螺旋缘、Corti器、螺旋神经元等处，提示HMGB1的表达可能与耳蜗内环境稳定、听觉通路的建立和听觉形成密切相关。HMGB1在听觉形成前的动态表达表明其可能在小鼠耳蜗的形态发育过程中发挥十分重要的作用。