高效液相色谱法测定纳他霉素假阳性结果的原因及其对策分析

李月月 贺亚如 磨家佳

摘 要：分析了高效液相色谱法测定月饼中纳他霉素时产生假阳性的原因，并给出了相应的对策建议。市场抽检的30个月饼样品中过半出现疑似目标峰，通过加标实验、改变流动相比例、更换色谱柱及采用二极管阵列检测器（DAD）光谱分析定性等方法排除假阳性。结果表明，采用DAD的光谱分析法佐以加标实验可以有效排除假阳性。

关键词：高效液相色谱;纳他霉素;DAD;假阳性

纳他霉素是一种由多种链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类[1]，可以广泛有效的抑制各种霉菌的生长，延长食品的保质期而不影响其口味和外观[2]，在食品工业中有一定的应用价值[3]。纳他霉素虽然是国家允许使用的防腐剂，但过量食用，纳他霉素可中和抗体，损害身体健康[4]。

国家标准GB/T 21915-2008中规定可用高效液相色谱（配紫外检测器）法来测定食品中的纳他霉素，但对于一些复杂样品如糕点，基质复杂，前处理难以消除部分基质的干扰，容易出现假阳性的现象[5]，直接影响结果的准确性，因此如何排除假阳性显得非常关键。

1 实验过程

1.1 试剂

纳他霉素标准品（纯度为99.0%）;纳他霉素标准储备液（准确称取0.005 0 g纳他霉素标准品，用甲醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL的标准储备液）;甲醇（色谱纯）;乙腈（色谱纯）;冰乙酸（优级纯）。

1.2 仪器

天平（0.000 1 g，梅特勒）;高效液相色谱仪—配紫外检测器（岛津LC-2030C）;高效液相色谱仪—配二极管阵列检测器（赛默飞UltiMate3000）。

1.3 实验步骤

准确称取5.00 g月饼皮，置于离心管中，加入30 mL甲醇提取30 min，加水10 mL，摇匀后置于离心机中以3 500 r/min离心5 min，取上清液过膜后上机测定。

2 结果与讨论

本次实验中的30个月饼样品中过半出现了目标峰，因此首先考虑假阳性问题。实验过程中出现假阳性的原因有很多：样品受到了污染、样品基质复杂或存在其他干扰组分。根据以上原因分析，需要对假阳性峰进行逐一筛除。色谱中确认和排除假阳性峰的方法有：加标确认、改变色谱条件、方法比对、质谱确认等。

2.1 样品受到污染

在实验前处理过程中，如果样品受到污染，结果会出现假阳性。处理方法是按照同样的方法，对样品进行重新取样、制样、称样，使用清洁的容器重新进行前处理操作，并同时做空白试验。结果显示空白样品中未发现目标峰，而重新处理后的样品目标峰仍然存在，这样就排除了样品在前处理中代入污染物和容器被污染的可能性。

2.2 样品中存在干扰物

当样品中存在干扰物时，首先考虑对该样品进行加标。选取一个出现疑似目标峰的样品793（图1a）进行加标，检测结果如图1b所示，加标样品中的纳他霉素峰与疑似目标峰完全重合在一起。

为分离793加标样品中加标峰和干扰峰，首先考虑调整流动相，将甲醇变为乙腈，并改变流动相比例，随着有机相的减少，出峰时间推后，目标峰出现分离，但没有完全分离。然后更换色谱柱，出峰时间推迟，但仍然与标准品保留时间一致，无法判断是否为假阳性。

2.3 仪器原因

2.3.1 紫外检测器

纳他霉素的检测一般使用配有紫外检测器的高效液相色谱仪，从保留时间来判断目标峰是否为纳他霉素。但是对于复杂基质样品，现有前处理手段无法排除所有干扰，假阳性问题无法彻底排除。图2为纳他霉素标准品（图2a）与样品793（图2b）的色谱图，从图中可以看出，样品793的目标峰与标准品中的纳他霉素峰保留时间十分接近，可以判定为阳性样品。但是由于过半样品检测出相似的目标峰，因此，首先考虑假阳性问题。

2.3.2 二极管阵列检测器

二极管阵列检测器（DAD）不仅可检测纯度，也可随色谱峰的流出自动采集峰顶光谱图，与计算机谱库贮存的标准光谱图进行对比检索[6]，大大提高了定性的可信度。

从图3可以看出样品793目标峰的光谱图（图3b）与纳他霉素标品（图3a）的光谱图的最大吸收波长与峰型走势都不同，而加标样品的纳他霉素峰（图3c）与纳他霉素标品的光谱图基本一致，因此可以判定样品793为假阳性。

3 结论

液相色谱法定性需要谨慎，保留时间接近或一致也可能不是同一种物质，当出现可疑数据时，应经过多方验证加以排除。实验表明，DAD光谱分析法佐以加标实验，可以有效排除糕点中纳他霉素检测的假阳性问题，此法简单快速，适用于大部分假阳性问题的判断，是解决假阳性问题的理想方法。

参考文献

[1]WANG S H， LIU F， HOU Z W， et aL. Enhancement of natamycin production on streptomyces gilvosporeus by chromosomaL integation of the vitreosciLLa hemogLobin gene（vgh）[J].Word J MicrobioL BiotechnoL， 2014，30（4）：1369-1376.

[2]DONG X H， GAO W J， HE X P. AntifungaL efficacy of natamycin in experimentaL fusarium soLani keratitis[J].Int J OphthaLmoL，2012，5（2）：143-146.

[3]徐宝兴，王艳芬，孙冬梅，等.纳他霉素的特性及研究进展[J].安徽农业科学，2014，42（22）：7426-7428.

[4]Repizo， L.M.， Martinez， L.D.， OLsina， R.A. et aL. A noveL and rapid method for determination of natamycin in wines based on ultrahigh-performance Liquid chromatography coupLed to tandem mass spectrometry：vaLidation according to the 2002/657/EC European decision[J].AnaL BioanaL Chem，2012，402：965-973.

[5]莫紫梅.高效液相色譜法测定糕点中纳他霉素的含量[J].粮食与饲料工业，2016，8（16）：66-68.

[6]丁涛，徐锦忠，李建忠，等.高效液相色谱-二极管阵列检测及电喷雾串联质谱法测定植物源性蛋白中残留的三聚氰胺[J].色谱，2008，6（1）：6-9.