慢性原发免疫性血小板减少症患者血小板microRNA差异表达的研究

余文俊 林建雄 张泽文

汕头大学医学院第二附属医院血液肿瘤科，广东汕头 515400

microRNA 属于一种非编码小RNA，约为20 ～25 个核苷酸大小，具有高度保守性。通过核酸互补序列，miRNA 可对特定的目标mRNA 进行识别，对其翻译作用进行抑制，并促进其降解，进而使蛋白质的合成得以抑制，起到对基因表达进行调控的作用[1]。在多种生物学过程中均有miRNA 的功能参与，且有相关研究表明，在疾病的治疗情况、诱发以及疾病发展中，某些特定miRNA 均有参与，且其表达谱可用作疾病预后以及诊断期间的指标[2]。慢性原发免疫性血小板减少症（ITP）是由于机体生成针对血小板自身抗原的抗体而诱发的出血性免疫性疾病，疾病会致使血小板被破坏，且血小板的生成过程也受到影响，进而导致血小板含量降低[3]。目前，临床尚未发现该疾病的主要发病机制，但有相关研究提示[4]，该疾病患者的基因组DNA 低甲基化且基因谱表达异常。故本研究特选取2018 年6 月30 日～2019 年9 月25 日在我院接受治疗的慢性原发免疫性血小板减少症患者20 例的临床资料进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选 取2018 年6 月30 日～2019 年9 月25 日在我院接受治疗的ITP 患者20 例作为临床研究对象进行回顾性分析，并以此为实验组，再选取20 例健康群体为对照组。实验组中女10 例，男10 例，年龄25 ～55 岁，平均（42.0±3.4）岁。血小板计数（3.0 ～50）×109/L，平均血小板计数为（25.76±3.56）×109/L。对照组中男10 例，女10例。年龄24 ～54 岁，平均（38.8±3.6）岁。血小板计数（170 ～345）×109/L，平均血小板计数为（276.43±31.99）×109/L。

纳入标准[5]：（1）知情同意书经患者及其家属签署，本研究经医院伦理委员会同意；（2）成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016 年版）相符，即血小板补体C3 增多、血小板膜表面相关抗体增多、血小板生存时间缩短、切脾治疗有效或激素治疗有效，骨髓检查存在有巨核细胞成熟障碍，且骨髓中巨核细胞数不减少，脾脏轻微增大或不增大，多次化验检查血小板计数减少；（3）以多部位与黏膜内脏出血、皮肤瘀点或瘀斑为主要临床表现。

排除标准：（1）明确病因的血小板减少症；（2）精神病患者；（3）合并有糖尿病、肾、肝、心等严重原发病；（4）哺乳期或妊娠期妇女。

1.2 方法

1.2.1 分离microRNA 从肘静脉抽取5mL 外周血加入至含有EDTA-K2抗凝剂的试管中，通过室温条件下通过梯度离心法制成富血小板血浆（PRP），按Invitrogen 公司Trizol 总RNA 分离试剂盒说明书进行，进行RNA 提取。后对RNA 浓度及纯度应用由Nanodrop 科技公司生产的ND- 1000Nanodrop 分光光度计进行测定，并对RNA 完整性应用凝胶电泳进行验证。分离miRNA，按照 miRNeasy mini Kit（QIAGEN） 试剂盒的说明书进行操作。

1.2.2 microRNA 扫描、芯片杂交以及标记 标记microRNA 按照miRCURYTMHy3TM/Hy5TM标记试剂盒的说明书进行操作，杂交microRNA 的样本为Hy3TM标记样本，按照miRCURYTMLNA Array（v.16.0） 试剂盒标记试剂盒的说明书进行操作，两种试剂盒是由丹麦Exiqon 公司提供。对microRNA信号强度分析扫描应用由CA Foster City Axon Instruments 生产的Axon GenePix 4000B miRNA 芯片扫描仪。

1.2.3 处理以及分析芯片数据 将中位数标准化处理应用至对 microRNA 数据中，信号强度超过50，对两个样品间杂交信号强度校正后的比值进行统计学处理，比值低于0.5 以及比值高于2 为有统计学差异。如存在统计学差异，则应用MEV 软件对表达差异的 microRNA 行分层聚类分析。

1.3 观察指标

在具有统计学差异的microRNA 数据中将目的microRNA 选取处，实时对hsa-miR-181a、hsa-miR-148a 以 及hsa-miR-31 进 行RT-PCR，内参物为U6，逆转录反应条件： 16℃30min， 42℃40min，85 ℃ 5min。实 时PCR 反 应 条 件： 95 ℃10min，95℃ 10s，60℃ 1min，循环40 次。数据分析通过 2-△△Ct均数分析法进行[6]。

1.4 统计学处理

运用GenePix Pro6.0 软件提取保存的数据并导入Excel，进行数据统计分析，筛选慢性ITP 患者和健康对照者血小板差异表达的microRNA。

2 结果

2.1 提取的microRNA质量分析

对两组所有受检者的血小板样品进行microRNA 检测分析，将microRNA 以及总RNA 提取后进行电泳。说明两组混合样本中总RNA 有清晰的28S 以及18S 条带显现。且A260nm/A280nm比值以及样品质量均符合要求。见图1。

图1 提取的microRNA 及总RNA 电脉结果

2.2 两组受检者中microRNA的表达

两组受检者之间筛选出161 个microRNA 有差异表达，其中显著下调的表达为79 个，显著上调的表达为82 个。分层聚类分析显示，两组受检者的miRNA 表达谱差异显著，说明实验组中有特异性microRNA 表达谱存在。见图2。

图2 miRNA 表达谱差异，下调以绿色表示，上调以红色表示

2.3 验证目的microRNA RT-PCR

经实时定量PCR 显示，实验组血小板中hsa-miR-181a 以及hsa-miR-148a 表达减弱，hsa- miR-31表达增强，结果符合芯片检测结果。见图3。

3 讨论

图3 microRNA RT-PCR 验证结果，A、B、C 分别代表hsa- miR-31、hsa-miR-148a、hsa-miR-181a

miRCURYTMLNA Array （v.16.0）（丹麦Exiqon公司生产）中的探针有1891 个，包括了小鼠、大鼠、人类以及之相关所有病毒的m i c r o R N A，芯片选用miRCURYTM探针的技术基础为LNA，在检测microRNA 表达谱过程中具有较强的敏感性以及特异性[3，7]。本研究对两组受检者血小板混合标本中的microRNA 表达谱通过该芯片进行比较分析，以探讨慢性原发免疫性血小板减少症患者中microRNA 中表达是否有特异情况[8]。

本研究表明，两组混合样本中总RNA 有清晰的28S 以及18S 条带显现。且A260nm/A280nm 比值以及样品质量均符合要求。两组受检者之间筛选出161 个microRNA 有差异表达，其中显著下调的表达为79 个，显著上调的表达为82 个。分层聚类分析显示，两组受检者的 miRNA 表达谱差异显著，说明实验组中有特异性microRNA 表达谱存在。经实时定量PCR 表示，实验组血小板中hsa-miR-181a 以及hsa-miR-148a 表达减弱，hsa- miR-31表达增强，结果符合芯片检测结果。结合研究结果进行分析，ITP 属于自身免疫性疾病，疾病特征即为具有器官特异性，故该疾病患者多伴有不同类型的免疫异常。目前，临床对该疾病的发病机制尚不明确，多认为是一个多步骤的过程而诱发疾病，除了发育异常的巨核细胞、T 细胞活化以及自身反应性B 细胞分泌抗血小板抗体以外，补体、自然杀伤细胞、抗原呈递细胞等其他免疫元素的异常、巨核细胞成熟障碍、调节性T 细胞（Treg）功能异常和数量下降、细胞毒T 细胞介导的血小板裂解以及T 细胞向 Th1/Tc1 极化偏移均参与了疾病的发生[9-11]。并有相关研究发现[12]，该疾病患者存在基因组 DNA低甲基化以及扰素调控基因等表达异常，说明该疾病患者多伴有基因表达调控异常。

microRNA 的功能与肿瘤发生、器官形成以及细胞分化密切相关，且随着研究的深入发现，其还影响着机体的免疫机制。对获得性免疫反应、天然免疫反应以及免疫细胞的分化均有调节作用。在本研究中，对参与机体重要免疫调节过程以及参与疾病发展的microRNA 通过高通量芯片技术进行筛选，发现该疾病患者有诸多microRNA 存在异常表达。如T 细胞以及B 细胞的分化过程有microRNA-181a 参与，并在T 细胞成熟、发育时期通过 TCR 信号转导途径将多种磷酸酶的表达程度降低，使T 细胞敏感程度得以调节。结合本研究结果，该疾病患者中microRNA-181a 表达下调，提示了在免疫细胞异常过程中有参与。而患者的CD4+T 淋巴细胞克隆变多，对T 细胞凋亡有抵抗作用，进而使免疫反应得以维持。而microRNA-146a 对 TCR 的激活气道诱导作用，对T 细胞有一定的保护作用，使其避免被激活而导致凋亡发生[13]。结合本研究结果，该疾病患者中microRNA-146a 表达上调，提示了在T 细胞异常凋亡过程中有参与。microRNA-21 在获得性免疫过程中有参与，其水平上调对T 细胞凋亡有抑制作用。相关研究表明，microRNA-21 在牛皮癣、多发性硬化、SLE 等多种自身免疫性疾病中表达过高。microRNA-21 通过对DNA 甲基化转移酶1 靶向抑制，致使CD4+T 细胞基因组甲基化降低。而实验组患者有 DNA 低甲基化呈现，这可能与microRNA-21 的参与有关。

经两组受检者的microRNA 表达情况对比发现，实验组中有较多microRNA 异常表达，且与其他自身免疫性疾病中表达情况一致，如microRNA-29、microRNA-125b、microRNA-513a-5p、microRNA-146a、microRNA-181a、microRNA-15a、microRNA-21 等，提示此类microRNA 可能作为疾病发作的重要影响因子，对该疾病的诱发有直接影响作用。但目前国内外对该项研究仍较少，需通过进一步深入探究才能得出更有效的结论。

综上所述，microRNA 的异常表达可能对慢性原发免疫性血小板减少症的发病机制有关，可对其深入研究，进一步分析在该疾病患者中不同个体间的microRNA 的表达差异，以探讨其是否可作为该疾病的治疗靶点或诊断的生物学标志。