从JAK-STAT信号通路探讨痹证宁对风寒湿痹型类风湿关节炎的作用机制

何东初 张倩

【摘 要】目的：探讨痹证宁对风寒湿痹型类风湿关节炎JAK-STAT信号通路的影响及作用机制。方法：將70只Wistar大鼠按照随机数字表法分为空白对照组，模型对照组，痹证宁低、中、高剂量组（9，18，36 g·kg-1），甲氨蝶呤组（1 mg·kg-1）和中西医结合组（甲氨蝶呤1 mg·kg-1+痹证宁18 g·kg-1），每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠模拟风寒湿环境，采用Ⅱ型胶原诱导方法制备风寒湿痹型类风湿关节炎大鼠模型，各组大鼠给予相应药物干预。28 d后，观察大鼠关节肿胀度、关节滑膜组织白细胞介素-6（IL-6）含量、PIAS3、P-STAT3蛋白和JAK3、STAT3 mRNA表达情况。结果：痹证宁可显著降低风寒湿痹型类风湿关节炎模型大鼠的关节肿胀度，降低IL-6含量，抑制P-STAT3蛋白、JAK3和STAT3 mRNA过表达，增进PIAS3蛋白表达。结论：痹证宁有抗炎、免疫调节作用，其作用机制可能与抑制JAK-STAT信号通路的过度激活有关。

【关键词】 关节炎，类风湿;痹证宁;风寒湿痹;JAK-STAT信号通路

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect of Bizheng Ning（痹证宁）on JAK-STAT signal pathwayin rheumatoid arthritis of wind-cold-dampness bi type and its mechanism.Methods：Seventy Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，medium and high dose Bizheng Ning groups（9，18，36 g·kg-1），a methotrexate group（1 mg·kg-1）and a combination group（1 mg·kg-1 of methotrexate + 18 mg·kg-1 of Bizheng Ning）treated with Chinese and Western medicine.There were10 rats in each group.Except the blank control group，the other groups of rats were used to establish rheumatoid arthritis models of wind-cold-dampness bi type by the method of typeⅡ collagen induction.The rats in each group were given corresponding medicine intervention.After 28 days，the degree of joint swelling，the content of IL-6 in synovium tissue，PIAS3，the expressions of P-STAT3 protein，JAK3 and STAT3 mRNA were observed.Results：Bizheng Ning can significantly reduce the joint swelling and IL-6 content，inhibit the expressions of P-STAT3 protein，JAK3 and STAT3 mRNA，and increase the expression of PIAS3 protein.Conclusion：Bizheng Ning has anti-inflammatory and immunomodulatory effects，whose mechanism may be related to inhibiting the over activation of JAK-STAT signal pathway.

【Keywords】arthritis，rheumatoid;Bizheng Ning（痹证宁）;wind-cold-dampnessbi;JAK-STAT signal pathway

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种因高风险遗传、环境暴露等多种因素导致关节滑膜炎的自身免疫性疾病，其病变可累及内脏器官结构[1]。目前，临床治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药（NSAIDs）、改善病情抗风湿药（DMARDs）、糖皮质激素等，这些药物虽然能在一定程度上缓解病情，但需要长期服用，并且对患者的血细胞、肝肾功能都有不同程度的损害。随着疾病研究的深入，各种生物制剂相继出现，但其价格昂贵，且存在感染等不良反应[2-4]。因此，寻求高效低毒又个体化治疗的药物显得尤为重要。痹证宁是中国人民解放军中部战区总医院自拟中药复方，前期临床试验已证实本方可改善RA患者临床症状且不良反应少[5]。本研究将观察痹证宁对RA治疗效果并探讨其作用机制，现总结如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康Wistar大鼠70只，雌性，体质量（160±20）g，购于湖北省疾病防疫控制中心实验动物中心，动物许可证号SCXK（鄂）2015-0018。饲养温度（23±1）℃，湿度（60±10）%，光照和黑暗各12 h更替，每天补充饲料、饮用水保证正常喂养。

1.2 药品与试剂 痹证宁方由鹿角胶、制附子、威灵仙、青风藤等中药组成，药物购自中国人民解放军中部战区总医院并由其中药制剂室加工制作;甲氨蝶呤片[上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂，生产批号036190302];牛Ⅱ型胶原蛋白（biosharp公司）;弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，生产批号SLBW1457）;白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附检测试剂盒（武汉科鹿生物科技有限责任公司，生产批号16147145646）;抗P-STAT3抗体（美国CST公司，9145S，生产批号34）;抗PIAS3抗体（美国CST公司，4164S，生产批号2）。

1.3 主要仪器 台式离心机（上海安亭科学仪器厂，TGL-16c）;冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发公司，TGL-16）;制冰机（常熟市雪科电器有限公司，IMS-20）;PCR仪（杭州博日科技，基因扩增仪TC-XP）;荧光定量PCR仪（Life technologies，StepOne Real-Time PCR System）;酶标仪（Diatek公司，DR-200Bs）;电泳仪（北京市六一仪器厂，DYY-6C）;扫描仪（Canon，LiDE110）。

2 方 法

2.1 动物分组、模型制备及给药 将Wistar大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分为7组：空白对照组，模型对照组，痹证宁低、中、高剂量组（9，18，36 g·kg-1），甲氨蝶呤组（1 mg·kg-1）和中西医结合组（甲氨蝶呤1 mg·kg-1 + 痹证宁18 g·kg-1），每组10只。冰浴环境下将牛Ⅱ型胶原蛋白充分溶解于0.1 mol·L-1的冰醋酸，配成浓度为2 mg·mL-1的溶液。4 ℃放置过夜后与等体积完全弗氏佐剂充分乳化制成1 g·L-1的牛Ⅱ型胶原乳剂，于造模各组大鼠足跖及尾根部多点皮下注射配制好的胶原乳剂0.2 mL。除空白对照组外，将其余各组大鼠模拟风寒湿环境[6]，置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，同时伴以4级风力，每日20 min，持续14 d;首次免疫后第7天再次加强免疫1次，以制备风寒湿痹型RA大鼠动物模型;空白对照组大鼠于相同部位皮下注射等量生理盐水。造模第15天开始灌胃给药（记为1 d），空白对照组、模型对照组大鼠给予等体积生理盐水，痹证宁低、中、高剂量组分别给予相应剂量药物，每日1次，连续28 d;甲氨蝶呤组每周1次给药，共4次。

2.2 观察指标 观察各组大鼠足趾肿胀情况，从造模第15天开始，采用容积法检测各组大鼠右后肢容积，每周1次。关节肿胀度计算如下：肿胀度 = （造模前容积-造模后容积）/造模前容积×100%。给药28 d后，将大鼠处死，浸泡在新洁尔灭消毒液中5 min。于膝关节正中纵向切开皮肤，暴露膝关节，在髌骨上缘横向切断上面的肌肉和韧带，再从髌骨两侧向下分离，然后翻开髌骨，打开膝关节，可以看见髌骨下缘韧带上附着一层微黄发亮的组织，即滑膜组织，用手术刀将其分离出来。用同样的方法采集另一侧膝关节滑膜组织。分别采用ELISA法检测滑膜组织中IL-6水平，Western Blot法检测滑膜中PIAS3、P-STAT3蛋白的表达水平，采用Real time-PCR法对滑膜组织中JAK3、STAT3 mRNA表达水平进行检测，结果分析采用2-△△CT法。见表1。

2.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，进行单因素方差分析，多组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 痹证宁对大鼠关节滑膜组织IL-6含量的影响 模型对照组比空白对照组滑膜组织IL-6含量显著升高（P < 0.01），提示造模成功;给药组较模型对照组均有所下降，其中，痹证宁中剂量组、甲氨蝶呤组、中西医结合组差异有统计学意义

（P < 0.01）;在给药组中，中西医结合组的IL-6含量最低，与痹证宁各剂量组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表2。

3.2 痹证宁对大鼠关节肿胀度的影响 各模型组大鼠关节肿胀度与空白对照组比较显著升高（P < 0.01）;与模型对照组比较，甲氨蝶呤组、中西医结合组自给药7 d，痹证宁给药14 d均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.01）;给药14 d开始，中西医结合组抗关节肿胀作用明显优于其他给药组（P < 0.01）;痹证宁各剂量组中，至给药28 d，中剂量组较低，高剂量组显著降低（P < 0.05）。见表3。

3.3 痹证宁对大鼠关节滑膜P-STAT3、PIAS3蛋白表达的影响 与空白对照组比较，模型对照组、痹证宁各剂量组、甲氨蝶呤组大鼠滑膜组织P-STAT3蛋白表达显著升高（P < 0.01），而模型对照组PIAS3蛋白表达较空白对照组上升，但差异无统计学意义（P ﹥ 0.05）;与模型对照组比较，痹证宁各剂量组、甲氨蝶呤组和中西医结合组P-STAT3表达明显降低（P < 0.01），痹证宁中剂量组、甲氨蝶呤组和中西医结合组PIAS3表达显著升高（P < 0.01）。其中，中西医结合组相较其他给药组P-STAT3显著降低、PIAS3表达明显上升，差异有统计学意义（P < 0.01）;而在痹证宁各剂量组中，痹证宁中剂量组大鼠关节滑膜P-STAT3蛋白表达明显低于痹证宁低、高剂量组（P < 0.01）。见圖1、表4。

3.4 痹证宁对大鼠关节滑膜JAK3、STAT3 mRNA表达的影响 模型对照组、痹证宁各剂量组和甲氨蝶呤组大鼠滑膜JAK3、STAT3 mRNA表达较空白对照组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.01）;与模型对照组比较，痹证宁各剂量组、甲氨蝶呤组和中西医结合组JAK3、STAT3 mRNA表达明显降低（P < 0.01），而与其他给药组比较，中西医结合组JAK3、STAT3 mRNA表达显著降低（P < 0.01）;痹证宁中剂量组大鼠关节滑膜STAT3 mRNA表达低于痹证宁低、高剂量组（P < 0.01），而在JAK3 mRNA表达上，痹证宁中剂量组明显低于高剂量组（P < 0.01），与痹证宁低剂量组比较，差异无统计学意义（P ﹥ 0.05）。见表5。

4 讨 论

RA属中医学“痹证”范畴。《幼科全针》中“痹者，内因肝血不足”，《灵枢·阴阳二十五人》中“血气皆少……善痹骨痛”提示气血亏虚、肝肾不足是痹证之内因，《素问·痹论篇》中：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”表示风寒湿邪是导致痹证发生的外在因素。故本院自拟痹证宁方，由附子、威灵仙、青风藤、徐长卿、细辛、独活、生薏苡仁等16味中药组成，有补益气血肝肾、风寒湿邪得调的功效。其中，制附子[7]具有消除关节肿胀、改善滑膜组织病理变化等作用;威灵仙总皂苷[8-9]可降低IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子-α的含量，抑制P-JAK2、P-STAT3蛋白表达，有抗炎镇痛、调节免疫的作用;青风藤[10]可降低核转录因子κB受体活化因子配体/骨保护素水平，抑制破骨细胞生成，对关节破坏起到抑制作用。

胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型因其病理改变与RA患者相似度最高，是目前公认的筛选治疗RA药物的理想模型[11]。近年来研究表明，促炎细胞因子经JAK/STAT信号通路激活是RA的发病机制和病程进展中的关键事件[12]。JAK-STAT信号通路参与多种疾病的免疫、分化、凋亡和肿瘤形成等过程，是细胞内蛋白质之间的相互作用链[13]。细胞因子与其相应的膜受体联系，JAK沉淀激活，介导STAT的酪氨酸磷酸化形成STAT二聚体，转移至细胞核与相应DNA结合，并最终调控基因转录。其中，IL-6与JAK1、JAK2、TYK2结合，诱导STAT3的激活，其水平的升高与T细胞和单核细胞的STAT3磷酸化水平密切相关。而STAT3失调后，可失去对成纤维样滑膜细胞凋亡的抑制作用，同时对抗体的产生、T细胞存活也失去调节作用[14-15]。PIAS3是调节STAT3过度激活的抑制因子，通过结合STAT3DNA结合域，与二聚体相互作用阻断其转录，从而抑制细胞因子信号转导[16]。在淋巴细胞大量表达的JAK3参与介导IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15等多种细胞因子的信号转导，对调节免疫功能、修复软骨组织有着重要作用[17-18]。针对JAK3的小分子抑制剂Tofacitinib也已被美国FDA批准上市[12]，因此，JAK-STAT信号通路在RA起病和发展过程中发挥着重要调控作用，特异性阻断JAK3/STAT3通路成为治疗RA的靶点。

本课题主要建立风寒湿痹型CIA大鼠模型，观察痹证宁对RA活动期关节肿胀度的影响及炎性因子IL-6水平表达情况，滑膜组织中PIAS3、P-STAT3蛋白表达，以及JAK3、STAT3 mRNA表达水平的高低，探讨痹证宁治疗RA的可能作用靶点。实验结果显示，痹证宁各剂量组明显减轻风寒湿痹型CIA大鼠关节肿胀度，对IL-6含量、P-STAT3蛋白，以及JAK3、STAT3 mRNA的过表达较模型对照组均有抑制作用，PIAS3表达上升。因此，痹证宁可能是通过降低IL-6细胞因子含量，抑制JAK3/STAT3信号通路的过度激活状态，同时增进PIAS3对STAT3的抑制作用来改善关节破坏，延缓RA病情发展。而痹证宁联合甲氨蝶呤的疗效均优于单一用药，其对JAK-STAT信号通路中PIAS3、P-STAT3、JAK3、STAT3的作用也强于其他各组，为临床治疗RA提供实验依据。其中痹证宁中剂量组的作用效果较低、高剂量组显著，可能与中剂量组血药浓度较高，药物吸收更好，相对于高剂量组无胃肠道反应等有关。相关预实验研究提示中剂量疗效好，故而选取痹证宁中剂量联合甲氨蝶呤用药，下一步可继续研究痹证宁最佳剂量以及联合用药配比关系。

综上所述，本研究在前期临床观察基础上探讨痹证宁对RA的JAK-STAT信号通路的影响。结果表明，痹证宁有抗炎、免疫调节作用，其作用机制可能与抑制JAK-STAT信号通路的过度激活有关。可考虑进行其他信号通路相关指标检测及滑膜细胞培养实验，进一步确定痹证宁对RA的治疗及多靶点作用机制。

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