上尿路尿路上皮癌Slit引导配体3的表达与临床病理特征以及预后的关系

吴西抗 王 跃 贺慧颖*

(1. 北京大学医学部病理系 北京大学第三医院病理科,北京 100191；2. 北京大学首钢医院病理科,北京 100144)

尿路上皮癌(urothelial carcinomas，UCs)是第四大常见的肿瘤[1-2]。UCs可以发生在下尿路(膀胱和尿道)或上尿路(肾盂和输尿管)。其中膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)占UCs的90%～95%，是最常见的尿路上皮恶性肿瘤[3]。上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma, UTUC)在全球范围内是一种相对少见的、具有高复发率和进展率的恶性侵袭性肿瘤，约60%的UTUC患者在诊断时肿瘤已发生浸润[2]。在西方国家，UTUC占所有尿路上皮恶性肿瘤的5%～10%，其发病率约为2/100 000[2]。在中国，UTUC流行病学和临床特点与西方国家有明显的差异，表现为发病率较高，UTUC的发病率约为8/100 000，约占尿路上皮癌的20%～30%；且更好发于女性，男女比例为1∶1.3，而在欧洲国家男女比例约为3∶1；输尿管UTUC的发病率为西方国家的2倍；相对于男性患者，女性患者具有分期高、体积大和淋巴结转移率高的临床特点；在中国，主要的危险因素为服用含有马兜铃酸的中药，而在西方国家为烟草[2, 4-5]。鉴于UTUC在中国具有特殊的发病情况，因此寻找国人UTUC的预后因素具有重要的意义。以往的报道表明，Slit引导配体3(Slit guidance ligand 3，Slit3)在甲状腺癌[6]、恶性黑色素瘤[7]及结直肠癌[8]等肿瘤中起抑癌作用。本研究通过检测UTUC标本中Slit3的表达情况，探究Slit3表达与UTUC患者临床病理特征和预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2007年1月至2017年3月在北京大学首钢医院和北京大学第三医院行肾输尿管根治术的90例UTUC患者的常规石蜡标本及临床病理资料，患者术前或术后均未接受化学药物治疗(以下简称化疗)，部分患者在复发或转移时接受了放射治疗。所有病例的病理信息均经两位泌尿病理医生独立评价。根据第8版AJCC肾盂和输尿管癌TNM分期[9]对病例进行分期。按照2016年WHO泌尿系统肿瘤分类对病例进行分级[10]。

1.2 组织微阵列(tissue microarrays，TMA) 的构建

TMA由90例UTUC样本和12例肿瘤周边的正常尿路上皮样本组成。基于先前的研究[11]，每个病例人工选择3个直径为2 mm的最佳肿瘤区域，通过手动式取样枪将其精确地排列到预制的TMA石蜡块中。

1.3 免疫组织化学方法

免疫组织化学染色采用EnVision两步法，用PBS代替一抗作为阴性对照，以正常尿路上皮作为阳性对照，使用兔抗人Slit3多克隆抗体(上海BBI生命科学有限公司；1∶200，4 ℃湿孵过夜)及二抗(HRP-抗鼠抗兔IgG，丹麦DAKO公司)进行染色。免疫组织化学检测结果由两名病理医师采用双盲法阅片，由于肿瘤细胞染色表现为胞质染色全或无，故仅根据细胞染色强度判定。按染色强度计分：无阳性着色计为0分，浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。在后续的数据分析中，0分和1分归为低表达组，2分和3分归为高表达组。

1.4 随访

每六个月更新患者随访数据，直至2017年6月。其中10名患者在手术后失访，最终有80例进行生存分析，中位随访28个月(1～101个月)。定义术后膀胱复发为在膀胱镜复查中发现膀胱肿物，并通过病理学确认。无病生存期(disease free survival，DFS)定义为UTUC手术与死亡之间的间隔。因UTUC发生死亡为事件，因其他原因死亡或仍存活的患者在末次随访时为删失。癌特异性生存期(cancer-specific survival，CSS)定义为从疾病诊断之日起到疾病出现复发、转移的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对所有数据进行统计学分析，分类变量组间比较采用卡方检验和Fisher确切概率法；两个因素之间的相关性采用Spearman等级相关分析；Pearson相关分析用于检验Slit3表达和UTUC临床病理特征的关系；生存分析单因素采用Kaplan-Meier法，多因素分析采用Cox回归模型。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征

本研究共纳入UTUC病例90例，患者发病年龄为41～88岁，平均年龄(68±9)岁，中位年龄为70岁。女性患者36例，男性患者54例。发生在左侧上尿路43例，右侧上尿路47例。其中发生在肾盂者38例，肾盂输尿管连接处1例，输尿管共6例，三处均有共6例。影像学等资料均未显示伴有膀胱癌。肿瘤最大径<3 cm者共51例，最大径≥3 cm者共39例。13例为多灶分布。高级别UTUC 64例，低级别UTUC 26例。Ta～T1期患者共38例，T2～T4期患者共52例，其中伴有肾小球硬化的27例。肿瘤伴有大片坏死者10例。具有神经侵犯者5例，有淋巴结转移者9例。发生膀胱复发的18例。

2.2 Slit3在UTUC中的表达

Slit3阳性定位于细胞质，呈棕黄色或褐色颗粒状，在癌旁正常尿路上皮中均呈强阳性。在90例UTUC中，44例为高表达，46例为低表达。在Slit3高表达的病例中，26例为高级别UTUC，18例为低级别UTUC；在Slit3低表达的病例中，38例为高级别UTUC，8例为低级别UTUC(图1)。

2.3 Slit3表达与UTUC临床病理特征的关系

图1 免疫组织化学染色结果

UTUC中Slit3表达与组织学分级(P=0.014)、肿瘤分期(P=0.006)相关，表明Slit3低表达的UTUC患者往往具有更高的组织学分级以及更晚的病理分期；同时Slit3低表达者具有更高的术后膀胱复发率。而Slit3表达与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、脉管内癌栓、神经侵犯、淋巴结转移、坏死和多灶分布等无关(表1)。

2.4 Slit3与UTUC患者预后的关系

Kaplan-Meier单因素分析显示Slit3低表达的UTUC患者其DFS为45.5个月；而高表达组其DFS为84.0个月，二者差异有统计学意义(P=0.006)(图2A)。此外Slit3低表达的UTUC患者其CSS为58.6个月，而高表达组其CSS为84.9个月，二者差异也有统计学意义(P=0.015)(图2B)。进一步，分别以CSS、DFS为因变量，表1中的因素为自变量进行多因素Cox回归分析，结果Slit3的表达状态对UTUC患者DFS和CSS的影响差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

3 讨论

UTUC在欧美国家是一种相对少见的恶性肿瘤，然而在中国UTUC的发病率约为欧美国家的2～3倍，且预后相对较差，且具有较为特殊的临床表现，如女性相对常见、与含有马兜铃酸的中药等具有相关性[2]。台湾学者Lee等[12]对2例高级别UTUC女性患者的肿瘤组织和正常组织进行二代测序分析，首次发现在高级别UTUC中Slit3呈低表达，因此在90例国人UTUC患者中对Slit3的表达与患者临床病理特征及预后的关系进行探讨。

Slit3最早发现于黑腹果蝇中[13]，随后在果蝇的中枢神经系统也发现了Slit3，并成功克隆[14]。在脊柱动物中Slit3具有3种同源亚型，分别为Slit1、Slit2和Slit3，其中Slit3由N末端信号肽、1个层黏连蛋白-G样结构域、4个富含亮氨酸的重复单位D1～D3、9个表皮生长因子重复序列和C末端半胱氨酸结构域组成，具有高度保守性[15]。Robo是Slit3的单跨膜受体，又称Robo受体。在哺乳类动物中，Robo受体具有4个亚型，分别为Robo1、Robo2、Robo3和Robo4。正常生理状态下，Slit3广泛表达于脑、心、肝、肾、骨骼肌等组织器官的线粒体中，通过和Robo4受体参与多种器官形成等生理功能。除此之外，Slit3还表达于血管内皮细胞和平滑肌细胞，具有较强的促血管生成的作用[16-17]。

表1 Slit3表达与UTUC临床病理特征的关系

*n=80;Slit3： Slit guidance ligand 3;UTUC: upper tract urothelial carcinoma.

图2 表达不同Slit3 UTUC患者Kaplan-Meier 生存曲线

病理状态下，Slit3在多种实体瘤中均有表达，参与肿瘤细胞的运动、生长及侵袭等生物学行为[18-19]。总体上Slit3发挥抑癌的作用，如Yu等[8]研究显示，在结直肠癌组织中，Slit3基因表达水平低于正常组织；在透明细胞性肾细胞癌和甲状腺癌中Slit3均表现为基因表达水平下调[6,20]；此外也有研究[7]显示Slit3参与组成的肽合物可以抑制恶性黑色素瘤细胞的侵袭能力。

基于以上的发现，笔者进一步研究及验证Slit3在UTUC中的表达及意义。结果显示与Slit3高表达的UTUC患者相比，Slit3低表达者往往具有组织学分级高、肿瘤分期晚和膀胱复发率高的特点。同时Slit3低表达的患者往往具有较低的DFS和CSS。但多因素分析显示Slit3并非UTUC的独立预后因素。

表2 影响 UTUC患者CSS、DFS的多因素COX分析

有研究显示Slit3作为miR-218-2的宿主基因，二者能够发挥协同作用，抑制多种肿瘤，如甲状腺癌[6]、结直肠癌[8]和胃癌[19]等肿瘤细胞的增生、迁移和转移。但目前并未发现在UTUC中存在miR-218-2的表达异常[10]，提示有其他的miRNA 参与Slit3对肿瘤细胞生物学的调控。有报道[21]显示Slit3的表达与肿瘤的分子亚型有关，如在EB病毒阳性和微卫星不稳定亚型的胃癌中表达降低，而在基因组稳定亚型的胃癌中表达升高。最近有研究[22]显示UTUC可分为四种具有不同生物学行为的分子亚型，而Slit3是否与UTUC分子亚型相关，则需进一步深入研究 。