载阿霉素混合胶束的制备及制剂工艺优化

韩利峰，欧阳惠枝，张 雪，林亚娟，徐 伟，王晓颖

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

聚合物胶束（polymeric micelles，PMs）由两亲性高分子聚合物在水性环境中自组装形成，其由亲水性外壳和疏水性内核组成且具有纳米级粒径结构的载体［1-2］，能将疏水性药物包载于其疏水内核中，以增加水难溶性药物的溶解度［3］。阿霉素（DOX）又称多柔比星，通过插入DNA双链结构及抑制拓扑异构酶Ⅱ（TOP2）的功能，破坏DNA结构，产生细胞毒性作用［4］。但其溶解度低且无靶向性，易被糖蛋白外排引起多药耐药性，并且在临床应用中易引发严重的毒副反应［5-6］。本课题组前期以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）、羧甲基壳聚糖（CMCS）、甘草次酸（GA）和大黄酸（R）为原料，分别合成了TPGS-甘草次酸偶联物（TG偶联物）和TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物（TCR偶联物），本研究以TG偶联物和TCR偶联物的混合物（TCR-TG）作为载体材料，制备载DOX的纳米胶束（DOX／TCR-TG胶束），并进行了制备工艺优化，为克服DOX临床应用缺陷寻找解决办法。

1 实验材料

1.1 试剂与材料 TG偶联物、TCR偶联物（自制）；盐酸阿霉素（DOX·HCl，大连美伦生物技术有限公司）；甲醇（色谱纯）、葡萄糖（分析纯）、甘露醇（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；MWCO 14000透析袋（上海绿鸟科技发展有限公司）。

1.2 仪器 NICOMPTM 380ZLS动态激光粒径测定仪（美国Santa Bbarbara公司）；MS105DU十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京谱析通用仪器有限责任公司）；JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD冷冻干燥机（德国Christ公司）。

2 方 法

2.1 DOX含量测定方法的建立 采用紫外-分光光度法对DOX／TCR-TG胶束中DOX的含量进行测定。

2.1.1 检测波长的确定 分别取DOX·HCl、TPGS、GA和R适量，用甲醇溶解稀释至合适浓度，在波长200～800 nm范围内进行扫描，确定DOX含量测定的检测波长。

2.1.2 线性关系考察 精密称取2 mg的DOX·HCl，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得0.2 mg／mL的DOX储备液，将此溶液稀释为 10、15、20、25、30 和 40 μg／mL的系列浓度，以甲醇为空白溶液，在检测波长处测定其吸光度值，以吸光度A对浓度C（μg／mL）进行线性回归。

2.1.3 精密度试验 取 15、20、40 μg／mL 的 DOX·HCl溶液，以甲醇为空白溶液，测定其吸光度值，计算RSD值。

2.1.4 回收率试验 精密称取TCR-TG载体材料6 mg，用1 mL水溶解，取100 μL置于5 mL容量瓶中，加入 0.2 mg／mL DOX·HCl储备液，甲醇稀释至刻度，分别配制成15、20、40 μg／mL 的 DOX·HCl溶液，每个浓度3份，在检测波长处测定吸光度值，计算回收率。

2.2 载药胶束制备及工艺考察

2.2.1 DOX·HCl脱盐 精密称取适量 DOX·HCl，用适量DMSO溶解后，磁力搅拌下加入三乙胺（DOX·HCl∶TEA＝1∶3，n／n），搅拌过夜，即得脱盐后 30 mg／mL DOX的DMSO溶液。

2.2.2 DOX／TCR-TG胶束制备 采用透析法制备，称取TCR偶联物和TG偶联物的混合载体材料18 mg，加超纯水3 mL，冰水浴探头超声10 min，缓慢滴加浓度为30 mg／mL DOX的DMSO溶液352.9 μL到TCR-TG混合载体溶液中，剧烈搅拌20 min后，冰水浴探头超声30 min，置透析袋中，蒸馏水为透析介质，透析12 h。结束透析后，冰水浴探头超声20 min，用0.8 μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥即得DOX／TCR-TG胶束。

2.2.3 TG偶联物和TCR偶联物混合比例考察 按照 TG 偶联物与 TCR 偶联物质量比为 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2 和 1∶3 称取混合偶联物共 18 mg，按照“2.2.2”项下方法制备DOX／TCR-TG胶束，滴加400 μL DOX的DMSO溶液（30 mg／mL），考察TG偶联物和TCR偶联物的不同混合比例对TCR-TG混合载体载药的影响。

2.2.4 药物与载体的质量比（药载比，m／m）的考察称取 “2.2.3”项下筛选得到的最佳混合比例载体材料，按照“2.2.2”项下方法，改变DOX的质量来考察药载比为 1∶1、1∶1.3、1∶1.5、1∶1.7 和 1∶2 时，对载药的影响。

2.3 DOX／TCR-TG胶束冻干制剂的制备 采用冷冻干燥技术将胶束冻干成固体，以利于胶束长期储存。以载药胶束冻干后外观、再分散性、粒径及分布、载药量和包封率为评价指标，对其冻干制剂进行研究。

2.3.1 载药胶束冻干制剂的制备 以“2.2”项下筛选的最佳比例按透析法制备DOX／TCR-TG胶束。结束透析后，冰水浴探头超声20 min，加入适量冻干保护剂，用0.8 μm滤膜过滤，冷冻干燥即得。

2.3.2 冻干保护剂考察 以甘露醇和葡萄糖为冻干保护剂，其用量均为0.1%、0.2%和 0.4%（m／v），按“2.3.1”项下方法制备，考察上述冻干保护剂对DOX／TCR-TG胶束的外观、再分散性、粒径及分布、载药量和包封率的影响。

2.4 载药量和包封率的测定 采用紫外-可见分光光度法测定DOX／TCR-TG胶束的载药量（drug loading capacity，DL）及其包封率（entrapment efficiency，EE）。精密称取 4 mg DOX／TCR-TG 胶束，加2 mL纯水溶解，取250 μL用甲醇稀释至5 mL容量瓶，按“2.1”项下方法测定DOX吸光度值，并计算DOX的浓度，根据下列公式计算DOX／TCR-TG胶束的DL和EE。

上式中，m1为载入胶束中的DOX的量，m2为DOX的投药量，m为DOX／TCR-TG胶束的质量。

2.5 DOX／TCR-TG胶束的粒径及分布 称取4 mg DOX／TCR-TG胶束，冰水浴探头超声10 min，配制成1 mg／mL的胶束水溶液，用0.8 μm滤膜过滤，常温下用激光粒度仪（DLS）测定胶束的粒径及分布。

2.6 DOX／TCR-TG胶束的形态学研究 使用透射电子显微镜（TEM）观察载药纳米胶束的形貌。取适量DOX／TCR-TG胶束溶液，滴于铜网上，用滤纸吸去多余的溶液，2%的磷钨酸溶液负染，室温干燥，于透射电镜下观察拍照。

3 结 果

3.1 DOX含量测定方法的建立

3.1.1 DOX含量检测波长的确定 对DOX·HCl、TPGS、GA和R进行紫外全波长扫描，以甲醇为空白对照，确定在498 nm为DOX的测定波长，在该波长下其他各成分对DOX测定无干扰，见图1。

3.1.2 DOX标准曲线及线性范围 吸光度A对浓度C（μg／mL）进行线性回归，绘制标准曲线。线性回归方程为 A＝0.020 7C－0.022 2（r＝0.999 5），在 15～40 μg／mL浓度范围内线性关系良好。

3.1.3 精密度和回收率 高、中和低3个浓度的精密度与回收率均符合方法学要求，其中日内精密度RSD值分别为0.72%、0.39%和0.73%；日间精密度分别为1.06%、1.42%和1.18%；回收率分别是（100.11±0.98）%、（101.98±2.61）%和（99.70±1.91）%。

3.2 TG偶联物与TCR偶联物混合比例的影响TG偶联物与TCR偶联物混合比例对包载DOX的影响，见表1。TG偶联物与TCR偶联物混合比为2∶1、1∶1 和 1∶2 时，载药量和包封率均较其他比例的高，粒径相差不大，且混合比为1∶2时，Zeta电位值为（-20.07±2.76）mV，稳定性更好，故确定 TG 偶联物与TCR偶联物的混合投料比为1∶2。

表1 TG偶联物与TCR偶联物比例对载药能力的影响

表1 TG偶联物与TCR偶联物比例对载药能力的影响

TG∶TCR／（m ／m）3∶1 2∶1 1∶1 1∶2 1∶3 1∶4粒径／nm 118.97±2.16 142.67±20.39 158.70±25.51 144.37±33.80 145.40±23.51 271.97±29.12粒径分布／PDI 0.15±0.03 0.14±0.05 0.14±0.02 0.18±0.01 0.21±0.03 0.16±0.10 Zeta 电位 ／mV-4.23±5.39-14.03±1.63-15.87±4.51-20.07±2.76-16.86±6.42-15.05±1.75 DL／%22.54±2.77 25.77±1.63 25.68±1.37 26.45±1.36 23.48±1.43 20.53±3.36 EE／%42.35±4.90 53.34±1.29 53.54±7.39 56.12±4.44 50.73±4.50 41.14±7.28

3.3 药载比的影响 药物与载体材料的投料比对混合聚合物胶束包载DOX能力的影响见表2。由表可知，当药载比为1∶1时，载药量最高，但其粒径较大，Zeta电位绝对值最小，故稳定性较差。而药载比为 1∶1.7 时，其粒径为（121.3±8.49）nm，且包封率达到（62.59±6.39）%，故综合考虑粒径及分布、Zeta电位、载药量和包封率，最终确定药物与载体的投料比为 1∶1.7。

表2 药载比对载药能力的影响

表2 药载比对载药能力的影响

DOX∶TCR-TG／（m／m）1∶1 1∶3 1∶1.5 1∶1.7 1∶2粒径／nm 140.53±6.43 132.27±10.70 133.43±37.25 121.30±8.49 116.20±5.81粒径分布／PDI 0.19±0.02 0.17±0.01 0.15±0.02 0.21±0.02 0.16±0.02 Zeta 电位 ／mV-17.39±1.23-20.63±2.59-20.33±0.8-21.90±0.2-20.80±2.6 DL／%33.26±2.59 29.06±1.13 27.94±0.69 31.22±3.19 23.59±1.15 EE／%47.46±2.58 51.11±1.55 54.85±1.95 62.59±6.39 55.61±4.51

3.4 不同冻干保护剂的影响 冻干保护剂对DOX／TCR-TG胶束冻干制剂研究结果见表3。DOX／TCRTG冻干制剂均具有良好的复溶性，复溶后均为红色澄清透明液体。综合考虑各考察指标，最终选用0.1%甘露醇为冻干保护剂，虽然粒径稍大，但其分布均匀，包封率、载药量最好。

表3 不同冻干保护剂的影响

表3 不同冻干保护剂的影响

冻干保护剂无保护剂0.1%甘露醇0.2%甘露醇0.4%甘露醇0.1%葡萄糖0.2%葡萄糖0.4%葡萄糖粒径／nm 133.77±9.15 160.57±21.72 137.97±7.15 136.70±1.22 137.57±1.27 128.20±2.43 131.17±6.37粒径分布／PDI 0.14±0.01 0.11±0.04 0.11±0.01 0.09±0.03 0.10±0.03 0.12±0.01 0.10±0.02 Zeta 电位 ／mV-18.41±2.64-17.65±1.45-12.69±3.03-16.19±7.52-13.72±2.83-14.59±5.93-17.17±4.61 DL／%30.05±6.61 30.70±0.56 26.86±1.17 19.74±1.57 29.36±1.51 28.43±1.17 20.30±2.87 EE／%45.40±0.11 73.08±3.65 53.68±3.78 72.88±5.55 69.71±4.67 69.14±4.93 54.52±6.31

3.5 DOX／TCR-TG胶束粒径及形态学 DOX／TCRTG载药胶束的粒径分布如图2所示，TEM形态学特征图如图3所示，由图可见胶束粒径分布均匀，形态结构圆整。

4 讨 论

透析法是将两亲性聚合物和药物共同溶解于与水互溶的混合溶剂中，然后倒入透析袋中，置于水中透析除去混合溶剂，待溶剂除去完全，透析袋中便是包载药物的胶束水溶液。透析法具有操作简单、载药效率高等特点，故本研究采用透析法制DOX／TCR-TG混合胶束。

通过对DOX／TCR-TG胶束的粒径及分布、载药量和包封率的综合评价，最终确定TG偶联物和TCR偶联物的最佳混合比例为1:2，DOX与TCR-TG载体的最佳药载比为1:1.7，所制备载药胶束粒径较小，分布均匀，载药量和包封率均较高，为后续深入研究该胶束递药系统奠定了良好的基础。

本文所用载体材料TG偶联物中甘草次酸具有肝靶向性，有利于引导DOX到达肝部治疗肝癌；TG偶联物和TCR偶联物中的TPGS具有P-糖蛋白抑制功能，有利于克服DOX在应用中多药耐药现象的发生；并且该两种偶联物混合后对DOX有良好的增溶作用，克服了DOX水溶性差的缺点。综上，该混合胶束对DOX的包载和递送作用具有较好的临床应用前景，其体内、外研究将进一步深入研究。