优化HPLC进行甘地胶囊中黄芩苷的含量测定

徐人杰 ，黄 洁 ，徐阿晶

（1.上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092；2.绍兴市妇幼保健院，浙江 绍兴 312000）

甘地胶囊（gandicapsule，GDC）为上海交通大学医学院附属新华医院自制制剂（批准文号：沪药制字Z04180947；委托上海方心制药科技有限公司生产）。甘地胶囊具有益气养阴、活血祛瘀的功效，目前临床常用于治疗糖尿病及糖尿病引起的微血管病变，疗效确切［1-3］。魏昕等［4］发现甘地胶囊可联合常规治疗用于糖尿病肾病，疗效及安全性均较好。甘地胶囊由八味中药构成，其中黄芪、黄芩和山茱萸为君药。我们前期研究发现，黄芩苷为甘地胶囊主要成分［5-7］，同时大鼠药动学实验也证实，黄芩苷为甘地胶囊口服后主要入血成分［8］。现有文献显示黄芩苷及其苷元具有一系列药理活性［9-10］。因此，针对甘地胶囊中黄芩苷的质量控制便尤为重要。应用HPLC测定黄芩药材或其他制剂中黄芩苷的研究已有报道［11-14］，但前期研究中发现应用现有HPLC法测定甘地胶囊中的黄芩苷结果不稳定，测定的结果也容易产生较大误差，所以有必要优化测定方法，提高实验方法的灵敏度。本文通过优化的HPLC法测定黄芩苷的含量，建立甘地胶囊的质量标准，以确保制剂安全有效。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Waters Symmtry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；G131513 二极管阵列检测器。

1.2 试药 黄芩苷（批号110715-200514，中国药品生物制品检定所）；样品（批号20161202、20161203、20161204，上海方心制药科技有限公司）；流动相用甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；其余试剂均为分析纯，购自中国医药（集团）上海化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 选用Waters Symmtry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱；参照《中国药典》2015版［15］黄芩含量测定项下黄芩苷的含量测定方法，流动相为甲醇：0.4%磷酸（43∶57）；流速 1.0 mL／min；柱温25℃；检测波长为280 nm。黄芩苷峰分离的理论塔板数不应低于2 500。

2.2 对照品溶液的配制 取黄芩苷对照品，精密称定，加适量甲醇，溶解成储备液，其浓度为0.319 mg／mL。随后精密吸取贮备液适量，继续加入甲醇稀释，摇匀，得黄芩苷对照品溶液，其质量浓度为31.9 μg／mL。

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 波长的选择 经液相紫外光谱全波长扫描比较后发现，黄芩苷在280 nm处具有最大吸收波长。同时扫描供试品及对照品溶液后发现，两者的黄芩苷紫外光图谱一致。

2.3.2 流动相选择 根据既往文献，本试验设置了3种比例的流动相配比，其中当采用甲醇：0.4%磷酸（47∶53）时，供试品溶液出峰时间 8 min，但有杂峰混入，黄芩苷峰受到干扰不纯；当采用甲醇：0.4%磷酸（45∶55）时，供试品溶液出峰时间 10 min，分离度 1.46，未达到分离要求；甲醇：0.4%磷酸（43∶57），供试品溶液出峰时间13 min，分离度达到要求，出峰时间前后也未发现杂峰。同时在上述流动相比例下供试品溶液中的黄芩苷与基质杂峰实现了良好的基线分离，见图 1。

2.4 提取条件的选择 考察不同提取溶剂、提取方法、提取时间下甘地胶囊中黄芩苷的提取，明确黄芩苷供试品溶液的制备方法。取装量差异下的甘地胶囊内容物约0.1 g，精密称定后置量瓶中，加70%乙醇直至刻度线，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再次加70%乙醇至刻度，收集其过滤后的续滤液即得供试品溶液。阴性对照无干扰，见表1。

表1 提取条件选择结果比较（批号20161202，μg／kg）

2.5 黄芩苷标准曲线及定量限确定 精密吸取对照品溶液各 1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，贮备液 2 μL，5 μL，10 μL，液相色谱法分别测定峰面积计算。 标准曲线回归方程为：y＝5.683 8＋3150.272 3x，r＝1。其中x为进样量（μg），y为黄芩苷的峰面积。本方法下黄芩苷定量限为0.031 9 μg／mL。黄芩苷对照品在0.0319～3.19 μg／mL范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取10 μL对照品溶液（31.9 μg／mL）进样，分别按上述处理条件连续重复进样6次，测定液相色谱的峰面积，由上述标准曲线经过计算得出黄芩苷含量进行精密度考察，结果发现6组平行试验所得黄芩苷的RSD为0.14%，表明本次实验所建立方法的精密度良好。

2.7 溶液稳定性 取甘地胶囊（批号20161202），按黄芩苷供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，并于 0、2、4、6、8、24 h 测定峰面积（批号 20161202），结果发现6组平行试验所得黄芩苷的RSD为0.49%，说明制备方法的稳定性良好。

2.8 重复性试验 取甘地胶囊（批号20161202），按黄芩苷供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，平行进行6次，记录峰面积，结果平行试验所得黄芩苷的RSD为0.43%，表明该方法重复性良好。

2.9 回收率试验 采用加样回收法进行回收率考察试验。精密称取已知黄芩苷含量的甘地胶囊50 mg（批号20161202，含量为1.75%），置50 mL量瓶中，精密吸取3.0 mL黄芩苷对照品溶液（0.319 mg／mL）加入量瓶，随后加70%乙醇适量溶解，按照供试品制备方法制备，该操作平行6份。取续滤液，根据建立的黄芩苷含量测定方法进行测定，结果如表2所示，6组供试品溶液的黄芩苷的平均加样回收率为99.62%，RSD为0.86%。

表2 回收率试验结果（n＝6）

2.10 样品测定 取3批次甘地胶囊（规格：0.3 g／粒），根据建立的黄芩苷含量测定方法，进行制备进样和含量测定，结果黄芩苷含量分别为1.75%，1.65%，1.52%，如表3所示。

表3 样品测定结果

3 讨 论

为了使黄芩苷的提取过程较完全彻底，且参考既往文献黄芩药材中通常选用70%乙醇为提取溶剂，因此本研究重点考察流动相、70%乙醇及乙醇。根据几种方法下黄芩苷供试品溶液制备方法及最终得率综合考察，选择取样量为0.1 g，50 mL容量瓶溶解，超声30 min进行研究。经过对提取溶剂的考察和比较，最终选择70%乙醇作为本次试验所采用的提取溶剂。

由于甘地胶囊在制备过程中已经历回流提取工艺过程，故本次实验主要考察回流及超声提取条件下黄芩苷含量的比较。通过比较发现，经超声及回流提取后的黄芩苷含量相近，考虑到操作过程的效率及便捷性，最终选择超声提取作为本次实验的提取方法。同时通过几组超声时间的比较发现，超声提取30 min下黄芩苷含量较高，为最佳的提取时间。

根据3批甘地胶囊中黄芩苷的含量测定结果进行分析，按照其平均含量的80%作为标准，以黄芩苷（C21H18O11）含量作为甘地胶囊中黄芩的质量控制指标，不得少于3.9 mg。今后将通过数据的积累完善继续精确甘地胶囊中的黄芩苷含量限度。

本研究建立的高效液相法可快速灵敏的测定甘地胶囊中黄芩苷的含量，经方法学考察，测定结果准确可信，可作甘地胶囊质量控制的指标之一。