光合细菌处理脂肪酸废水生产菌体蛋白研究

咸晓慧，李 良，林小琳，谢 满，董 钦，曲 晨，陈瑾影

(沈阳工业大学辽阳分校，辽宁 辽阳 111003)

脂肪酸生产废水是一种高酸度、高COD、高硫酸盐以及高色度废水。该类废水处理方法包括中和法[1-4]、生物处理法[5-12]、混凝法。鉴于光合细菌(PSB)在自然界碳、氮、硫等元素循环中的作用，且可以以有机物作为碳源。因此，本实验采用一种嗜盐光合细菌处理中和后的脂肪酸废水，回收菌体蛋白。同时将该菌体蛋白作为饵料，进行彩霞鱼喂养实验。

1 实 验

1.1 试剂、设备与仪器

1.1.1 试 剂

硫酸、硫酸银、重铬酸钾、硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、邻菲罗啉、硫酸汞、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、氢氧化钠、氯化钡、钼酸铵、磷酸二氢钾、抗坏血酸等均为分析纯试剂。蒸馏水为无氨蒸馏水。

1.1.2 主要仪器和设备

VIS-7220G可见分光光度计(配1 cm玻璃比色皿)；酸式滴定管；SHA-B型恒温水浴振荡器；RG-TDJ-5A型低速台式大容量离心机(配离心管)；全回流化学需氧量测定仪；凯氏定氮仪等。

1.2 废水和菌种来源

废水来源：辽阳市某脂肪酸厂。

菌种来源：自行培养，现存于环境工程实验室。

1.3 实验方法

1.3.1 预处理方法

脂肪酸废水用NaOH中和，分别调节pH为5、6、7、8、9，观察现象。然后降温析盐，测定析盐量。并按照规定的分析方法分析析盐前后废水。

1.3.2 菌种的驯化

营养盐溶液配方：EDTA 1.0 g/L、CaCl2·H2O 0.1 g/L、ZnSO4·7H2O 0.2 g/L、FeSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、CuSO4·5H2O 0.02 g/L、CoC12·6H2O 0.04 g/L、MnCl2·2H2O 0.1 g/L、MgC12·6H2O 10 g/L。

取无菌水和废水按照一定比例混合，投加适量的营养盐溶液和尿素，加入适量的菌液，摇匀。取样测量光密度值。

然后，放入培养箱中，在一定温度和光照下培养。每隔一段时间，取样测量光密度值，直到光密度值有下降趋势停止培养。以时间为横坐标，光密度为纵坐标，绘制生长曲线。从曲线中获得最佳培养时间。

1.3.3 影响条件考查

本实验考查的影响因素包括光照、营养盐溶液投加量、尿素投加量、菌液投加量。

1.3.4 重现性实验

1.3.5 应用实验

将收获的菌体用于彩霞鱼喂养试验，分两组进行实验，分别为对照组和实验组，每组彩霞鱼各20条。对照组投加高级热带鱼营养鱼粮，对照组饲喂菌体蛋白，每3天投加1次饵料，观察生长情况和死亡率。

1.4 分析方法

光密度OD500测定取水样在可见分光光度计上于500 nm处测量吸收光度值；蛋白质含量测定参照GB/T 5009.5-1985；化学需氧量(COD)测定参照HJ 828-2017；硫酸根测定参照GB 11899-89；氨氮测定参照HJ 537-2009；总磷测定参照GB 11893-1989 。

2 结果与讨论

2.1 废水分析结果

按照实验方法1.3.1操作，调节发现废水pH到5、6时，降温后有盐的晶体析出。而在pH为7、8、9时，降温后，废水凝固成一团，仅有极少量的废水析出。本实验选择用氢氧化钠调节pH为5～6。按照分析方法原废水和析盐后废水(以下简称废水)测定各项指标。结果见表1。

表1 中和前后水样分析结果Table 1 Analysis result of waste sample before neutralization

2.2 驯化结果

首先，将水样100 mL用无菌水以1:9稀释，投加营养盐溶液2 mL，尿素1 g，接种20 mL光合细菌菌液，放入培养箱中，在15 W日光灯和30 ℃条件下培养。每隔12 h测量光密度OD500，直到有下降趋势时，停止培养。绘制生长曲线。

图1 光合细菌生长曲线Fig.1 Growth curve of PSB

图2 光照对菌体蛋白产率的影响Fig.2 Effect of light on protein yield of mycelium

2.3 条件实验

2.3.1 光照的影响

取水样和无菌水以1:1混合，配成1000 mL水样。加入10 mL营养盐溶液，1 g尿素，用碳酸钙和碳酸氢钠控制溶液的pH为7～8之间，接种20 mL光合细菌菌液，放到恒温水浴震荡器中，调节温度为30 ℃。在日光、15、25、40、100白炽灯等光照条件下，进行培养，时间控制在72 h。离心分离菌体，干燥后称重，计算产率，所得结果见图2。由图2可以看出，日光照射时菌体蛋白产率最低，可能是因为光照时间短，导致产率低。使用白炽灯照射时，随着功率增大，蛋白产率增加。但是当功率增加到100 W时，蛋白产率有所降低，可能是温度高引起菌体不适应引起的。因此本实验选择40 W白炽灯作为最佳光源。

取样分析蛋白含量，结果见表2。

表2 光照对菌体蛋白含量的影响Table 2 Effect of light on protein content of mycelium

2.3.2 营养盐溶液投加量的影响

取水样和无菌水以1:1混合，配成7个1000 mL水样。分别加入0、2、4、6、8、10、12 mL营养盐溶液，1 g尿素，用碳酸钙和碳酸氢钠控制溶液的pH为7～8之间，接种20 mL光合细菌菌液，放到恒温水浴震荡器中，调节温度为30 ℃。在40 W白炽灯等光照条件下，进行培养，时间控制在72 h。离心分离菌体，干燥后称重，计算产率，所得结果见图3。由图3可以看出，营养盐溶液投加量蛋白产率有一定影响，随着投加量增加，蛋白产率逐渐增加，到了10 mL以后，蛋白产率趋于平缓。因此本实验选择营养盐溶液投加量10 mL作为最佳投加量。取样分析蛋白含量，结果见表3。

图3 营养盐投加量对菌体蛋白产率的影响Fig.3 Effect of nutrient salt dosage on yield of mycelium protein

图4 尿素投加量对菌体蛋白产率的影响Fig.4 Effect of urea dosage on yield of mycelium protein 表3 营养盐投加量对菌体蛋白质含量的影响Table 3 Effect of nutrient salt dosage on protein content of mycelium

编号营养盐投加量/mL蛋白含量/%1035.232236.113436.144635.765835.9961036.1271236.18

2.3.3 尿素投加量的影响

取水样和无菌水以1:1混合，配成1000 mL水样。加入10 mL营养盐溶液，分别加入尿素0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，用碳酸钙和碳酸氢钠控制溶液的pH为7～8之间，接种20 mL光合细菌菌液，放到恒温水浴震荡器中，调节温度为30 ℃。在40 W白炽灯等光照条件下，进行培养，时间控制在72 h。离心分离菌体，干燥后称重，计算产率，所得结果见图4。由图4可以看出，尿素投加量蛋白产率有一定影响，随着投加量增加，蛋白产率逐渐增加，到了2 g以后，蛋白产率趋于平缓。因此本实验选择尿素投加量2 g作为最佳投加量。取样分析蛋白含量，结果见表4。

表4 尿素投加量对菌体蛋白质含量的影响Table 4 Effect of urea dosage on protein content of mycelium

2.3.4 菌液投加量的影响

图5 菌液投加量对产率的影响Fig.5 Effect of PSB solution dosage on yield of mycelium protein 表5 菌液投加量对菌体蛋白质含量的影响Table 5 Effect of PSB solution dosage on protein content of mycelium

编号菌液投加量/mL蛋白含量/%1535.4521036.4231535.6842035.6652535.7963036.22

取水样和无菌水以1:1混合，配成1000 mL水样。加入10 mL营养盐溶液，2.0 g尿素，用碳酸钙和碳酸氢钠控制溶液的pH为7～8之间，接种5、10、15、20、25、30 mL光合细菌菌液，放到恒温水浴震荡器中，调节温度为30 ℃。在40 W白炽灯等光照条件下，进行培养，时间控制在72 h。离心分离菌体，干燥后称重，计算产率，所得结果见图5。由图5可以看出，菌液投加量蛋白产率有一定影响，随着投加量增加，蛋白产率逐渐增加，到了20 mL以后，蛋白产率趋于平缓。投加量少时，底物量太多，而微生物同化速率是一定的，因为培养时间是一定的，72 h，所以蛋白产率也就相对较少。而添加量到了20 mL以后，底物又略显不足，所以蛋白产率趋于平缓。故本实验选择菌液投加量20 mL作为最佳投加量。取样分析蛋白含量，结果见表5。

根据表5对菌体蛋白质含量的分析结果，说明本实验选择的菌体是处理废水的优势菌。

2.4 重现性实验

按照1.3.4进行实验，所结结果见表6。根据表6分析结果，废水中的各种指标还是很高，因此拟把回收菌体的废水回用于稀释原废水。另外，在脱盐时，应尽可能去除更多的硫酸盐，比如采用冷冻法，或者加热脱盐后废水，再析盐。

表6 重现性实验结果Table 6 Reproducibility experiment results

2.5 应用实验

按照1.3.5进行实验，所得结果见表7。

表7 应用实验结果Table 7 Applied experimental result

根据表7所示，采用光合细菌菌体蛋白作为饵料，喂养彩霞鱼，是可行的。对照组和实验组鱼的死亡是因为换水时，鱼跳到外面，捡回时受伤引起的。

3 结 论

首先对光合细菌进行了驯化，绘制了生长曲线，确定了菌体收获时间为72 h。然后考查了光照、营养盐溶液投加量、尿素投加量以及菌液投加量对菌体蛋白产率的影响，确定了最适生长条件：废水与无菌水以1:1混合，取混合液1000 mL，加入10 mL营养盐溶液，2.0 g尿素，用碳酸钙和碳酸氢钠控制溶液的pH为7～8之间，接种20 mL光合细菌菌液，放到恒温水浴震荡器中，调节温度为30 ℃。在40 W白炽灯等光照条件下，进行培养，时间控制在72 h。菌体蛋白产率为112.2 g/L废水，蛋白含量为35.85%。最后做了应用实验，一个月的喂养试验，彩霞鱼生长状况良好，证明该菌体蛋白可以作为鱼的饵料。