南瓜籽多肽的制备及其对人体皮肤细胞的体外作用

2020-06-19王培宇孙培冬

中国油脂 2020年6期

王培宇，孙培冬

(江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡 214122)

人体在正常生理过程中，体内自由基处于动态平衡，但生活节奏的加快、不良的饮食睡眠习惯、环境污染等会产生过多的自由基，打破这种平衡导致氧化应激。活性氧(ROS)是自由基的重要组成部分，过量的ROS会威胁细胞内氧化还原反应的有序进行，加速细胞老化甚至凋亡，进而影响人体健康。皮肤细胞由于还受到紫外线照射，更容易陷入ROS过剩的状态，造成氧化损伤。因此，抗氧化在近年来成为了人们研究的重要课题，天然抗氧化剂的开发日益受到重视[1-2]。

生物活性多肽不仅具有良好的抗氧化性能，而且具有优越的生物相容性、易吸收、健康安全等特点，成为全球天然抗氧化物研究热点。南瓜籽含丰富的油脂和蛋白质，营养丰富，尤其是其蛋白质中含多种人体必需的氨基酸，是制备多肽的优质蛋白质原料。张淑蓉等[3]使用木瓜蛋白酶制备南瓜籽蛋白多肽，其抗氧化活性可达到VC的20%以上。范三红等[4]使用酸性蛋白酶制备南瓜籽多肽，采用超滤技术截留的相对分子质量小于4 ku组分清除自由基能力优于截留的相对分子质量10 ku组分。目前，关于南瓜籽多肽报道[5-7]多集中于抗氧化活性，抗氧化指标也停留在化学方法，未从细胞水平进行评价。

本文以不同的酶水解南瓜籽蛋白，得到5种南瓜籽多肽，经抗氧化性和细胞增殖活性测定筛选，并建立人体皮肤细胞氧化损伤模型，探究南瓜籽多肽对人体皮肤细胞体外作用机制，为南瓜籽多肽的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

南瓜籽，原产地内蒙古，巴彦淖尔市大嫂食品有限责任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司；人皮肤成纤维细胞(HSF)、人永生化角质形成细胞(HaCat)，北纳创联生物科技有限公司；高糖培养液(DMEM)、磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰酶、青霉素-链霉素双抗，Thermo-Fisher公司；胎牛血清，Gibco公司；活性氧检测试剂盒、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，碧云天生物技术；二甲基亚砜(DMSO)、氢氧化钠等均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，Lyoquest Plus-85冷冻干燥器，Waters 1525EF高效液相色谱仪，日本东曹TSKgel 2000SWXL凝胶色谱柱(300 mm×7.8 mm)，Tecan Infinite 200 Pro多功能酶标仪，MCO-15AC细胞培养箱，SW-CJ-2FD超净工作台，Olympus Ckx41倒置生物显微镜，CARY Eclipse荧光分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 南瓜籽多肽的制备

参照文献[8-9]的方法制备南瓜籽蛋白和南瓜籽多肽。用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶-胰蛋白酶、碱性蛋白酶-风味蛋白酶酶解南瓜籽蛋白。不同酶解产物制备条件见表1。在加入蛋白酶之前，调节蛋白质分散液温度及pH至表1对应值。单酶酶解时间为4 h；双酶酶解过程中，第一种蛋白酶酶解2 h后灭活，再用第二种蛋白酶酶解2 h。酶解期间滴加0.5 mol/L NaOH溶液维持溶液pH不变。酶解结束，待混合液冷却至室温，加入1 mol/L HCl调节pH至等电点，离心收集上清液，冷冻干燥得多肽。由上述5种酶酶解所得南瓜籽多肽分别命名为JX、Y、F、JX-Y、JX-F。采用pH-Stat法[10]对水解度进行测定并按式(1)计算各多肽产率。

多肽产率=多肽的质量/蛋白的质量×100%

(1)

1.2.2 多肽相对分子质量分布的测定

将5种南瓜籽多肽溶解于超纯水中。根据相对分子质量不同的多肽在葡聚糖凝胶柱中流出时间的差异，测定各多肽相对分子质量分布。

1.2.3 多肽抗氧化性能测定

1.2.4 多肽对细胞增殖的影响

采用MTT法考察5种南瓜籽多肽在0.2 mg/mL 时对人皮肤成纤维细胞(HSF)及1.6 mg/mL时对人永生化角质形成细胞(HaCat)的增殖活性。取处于对数生长期的HSF和HaCat细胞，以20×103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μL(空白组除外)，培养箱中孵育24 h后，移除孔中培养液。以DMEM为溶剂分别配制0.2 mg/mL及1.6 mg/mL的样品溶液，每孔加入100 μL样品溶液孵育24 h，以100 μL DMEM代替样品作为对照组。移除孔中溶液，使用PBS冲洗2次，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，并向不含细胞的孔中加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液作为空白组，置于培养箱中孵育4 h[12]。孵育结束后每孔中加入100 μL DMSO，充分振荡5 min，使用酶标仪测定其在490 nm处的吸光值(OD)，按式(2)计算细胞活力。

细胞活力=(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%

(2)

1.2.5 H2O2诱导皮肤细胞氧化损伤模型建立

H2O2可以使细胞产生活性氧，打破细胞内活性氧动态平衡，诱导细胞衰老甚至凋亡。取处于对数生长期的HSF和HaCat细胞，以20×103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μL(空白组除外)，培养箱中孵育24 h后，移除孔中培养液。以DMEM为溶剂分别配制不同浓度的H2O2溶液，每孔加入100 μL H2O2溶液孵育1 h，以100 μL DMEM代替H2O2作为对照组。移除孔中溶液并使用PBS冲洗2次，每孔加入100 μL DMEM溶液，置于培养箱中孵育24 h[13-14]。按1.2.4方法测定吸光值，按式(2)计算细胞活力。选择细胞活力约70%时为最佳损伤条件。

1.2.6 多肽对氧化损伤细胞的修复作用

使用1.2.5中建立的HSF、HaCat损伤模型评价JX-Y对氧化损伤细胞的修复作用。接种细胞置于培养箱中孵育24 h后，移除孔中培养液，向含有HSF、HaCat细胞的孔中分别加入100 μL 1.4、2.8 mmol/L H2O2溶液，孵育1 h，以100 μL DMEM代替H2O2作为对照组。移除孔中溶液并使用PBS冲洗2次，每孔加入100 μL 以DMEM为溶剂配制的不同质量浓度的JX-Y溶液，置于培养箱中孵育24 h。按1.2.4方法测定吸光值，按式(2)计算细胞活力。

1.2.7 细胞内活性氧(ROS)测定

使用活性氧检测试剂盒测定HSF内活性氧水平。使用1.2.5中建立的损伤模型，加入以DMEM为溶剂配制的0.2 mg/mL的JX-Y溶液，孵育24 h，以100 μL DMEM溶液代替JX-Y溶液作为模型组。移除孔中培养液，胰酶消化、离心收集细胞。细胞中加入以DMEM为溶剂配制的10 μmol/L荧光探针溶液，使细胞浓度达到20×103个/mL，孵育30 min。离心并使用PBS冲洗2次，除去未进入细胞的荧光探针。使用荧光分光光度计测定样品在激发波长488 nm、发射波长525 nm处的荧光强度[15-16]。

2 结果与分析

2.1 南瓜籽多肽的制备

水解度指蛋白被分解为多肽的程度，通常作为蛋白水解程度的指标[17]。南瓜籽蛋白水解结果如图1所示。

图1 南瓜籽蛋白水解结果

从图1a可以看出，随着酶解时间的延长，水解度逐渐趋于平稳，4 h后JX、Y、F、JX-Y、JX-F的水解度分别为25.20%、12.02%、10.11%、27.23%、23.24%，其中JX-Y水解度最高。图1b显示，JX-Y产率最高，达39.20%。由此可见，使用碱性蛋白酶-胰蛋白酶可以得到更多的南瓜籽多肽。

2.2 南瓜籽多肽相对分子质量分布

由于葡聚糖凝胶特殊的网状结构，相对分子质量大的多肽先从凝胶柱中流出。根据多肽出峰情况进行峰面积积分，得出不同相对分子质量范围内多肽含量，结果见表2。

表2 5种酶解产物不同相对分子质量范围的多肽含量

由表2可见，5种酶解反应使南瓜籽蛋白链被不同程度、不同部位地切割，成功制得南瓜籽多肽，其中相对分子质量小于1 000 Da的多肽在JX-Y中占比最高，达92.72%。

2.3 南瓜籽多肽的抗氧化性能

图2 5种南瓜籽多肽的抗氧化性能

2.4 南瓜籽多肽对细胞增殖的影响

HSF、HaCat是人体皮肤细胞的重要组成部分，其中HSF位于皮肤真皮层，HaCat位于表皮层。南瓜籽多肽对细胞增殖的影响如图3所示。

图3 南瓜籽多肽对细胞增殖的影响

由图3可见，5种南瓜籽多肽中JX-Y促进细胞增殖性能最优，HSF、HaCat细胞活力分别达到116.15%、121.02%。

2.5 H2O2作用下HSF、HaCat细胞活力

H2O2作用下细胞活力如图4所示。

图4 H2O2作用下细胞活力

由图4可见，氧化损伤细胞1 h时，细胞活力随着H2O2浓度增加而降低，其中H2O2浓度分别为1.4、2.8 mmol/L时，HSF、HaCat细胞活力为72.21%、72.65%，接近70%。因此，分别以1.4、2.8 mmol/L H2O2作用HSF、HaCat细胞1 h建立氧化损伤模型。

2.6 南瓜籽多肽对氧化损伤细胞的修复作用

在5种南瓜籽多肽中，由于JX-Y抗氧化性能和促进细胞增殖性能均优于其他多肽，因此进一步考察JX-Y对H2O2诱导的HSF及HaCat氧化损伤修复作用，结果如图5所示。

图5 JX-Y对H2O2诱导的细胞损伤修复作用

从图5可以看出，1.4 mmol/L H2O2作用的HSF细胞活力仅为72.69%，加入JX-Y孵育24 h后，提高了细胞活力，当JX-Y质量浓度为0.2 mg/mL 时细胞活力达到最高，为86.54%。但当JX-Y质量浓度继续提高至0.8 mg/mL时，细胞活力低于模型组，说明JX-Y浓度过高并不利于HSF的生长。

从图5还可以看出，2.8 mol/L H2O2作用的HaCat细胞活力为73.65%，加入JX-Y孵育24 h后，同样提高了细胞活力，当JX-Y质量浓度为2.4 mg/mL时细胞活力达到最高,为91.54%。但当JX-Y质量浓度为4.0 mg/mL时，细胞活力低于模型组，这与HSF的表现相似。HaCat和HSF不同的是HSF更易受到H2O2的影响，HaCat需要更高的多肽质量浓度提高细胞活力。