油橄榄叶有效成分的提取及药理活性的研究进展

李 楠,赵兴文,郭美佳,吴 婧,姜 燕,*

(1.大理大学公共卫生学院,云南大理 671000; 2.大理农林职业技术学院食品工程学院,云南大理 671000)

油橄榄(OleaeuropaeaL.)属木犀科木犀榄属,栽培品种有较高食用价值,在福建、四川、云南等地分布广泛[1-2]。目前,国内油橄榄的栽培面积已有15000 hm2,年产鲜果6000 t,每年每棵油橄榄树修剪和采收过程会产生超过25 kg的油橄榄叶副产物[1-2]。现代生物技术研究发现:油橄榄叶中含有的抗氧化活性成分,如橄榄多酚、黄酮类化合物,含量高于橄榄果实和橄榄油[2-3]。现代药理学研究证明:油橄榄叶中的橄榄苦苷、羟基酪醇、木酚素类、黄酮类和咖啡酰苯乙醇苷类等化合物具有抗炎抑菌[4]、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和降血糖血脂等多种药理活性[5]。油橄榄叶中含有大量具有良好药理功效的活性成分,且随着研究的深入,油橄榄叶提取物已逐渐应用于保健食品、医药和化妆品等行业。

本文从油橄榄叶活性成分的提取工艺、分离和纯化技术的研究进展、油橄榄叶提取物的药理活性以及其他增值利用加以综述,以期为油橄榄叶资源的进一步研究与开发提供参考。

1 油橄榄叶活性成分的提取、分离及纯化技术

油橄榄叶活性成分的研究一方面是针对不同油橄榄品种之间活性成分差异的分析,另外一方面集中于如何有效提取、分离和纯化油橄榄叶中活性成分,拓展该类化合物的应用范围。油橄榄品种繁多,不同品种油橄榄叶中营养及活性成分差异显著。胡庆苹等[6]测定了19个品种油橄榄叶中8种营养成分和3种活性成分的含量。结果表明:膳食纤维、还原糖、橄榄苦苷是油橄榄叶的特征成分,与油橄榄叶的品质密切相关。3种活性成分的平均含量分别为:橄榄苦苷(74.57±13.91) g/kg、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(2.49±0.42) g/kg、芹菜素-7-O-葡萄糖苷(1.18±0.28) g/kg。耿树香等[7]分析了云南引种的16个品种油橄榄叶样品及13个品种的果渣样品中的多酚含量。油橄榄叶样品中多酚含量平均值为4.21%,果渣中多酚含量平均值为1.10%,油橄榄叶多酚含量高于果渣。

油橄榄叶活性成分常用的提取、分离和纯化的方法主要有微波辅助提取、超声波辅助提取、低压沸腾提取、高速逆流色谱分离、大孔吸附树脂分离纯化、酶法水解等[8-9]。

1.1 油橄榄叶活性成分的提取

微波辅助提取得到油橄榄叶中的总酚、总黄酮及橄榄苦苷的含量均高于热浸提法,且低温或真空冷冻干燥技术可以保留提取物的活性[10]。有研究通过超声波辅助乙醇溶液提取油橄榄叶总黄酮得率达5.83%[11],油橄榄叶总多酚得率达8.90%[12]。超声辅助提取油橄榄叶的水提物经浓缩、醇沉后冷冻干燥为粉末,产品不易吸湿且分散性好,可后续加工为片剂或胶囊等固体制剂[13]。AlShaal等[14]也对比了超声辅助水提及醇提油橄榄叶总多酚。油橄榄叶醇提物中总多酚的含量较高,但抗氧化性与水提物无显著性差异,且醇提物中橄榄苦苷的含量(88.50±9.67 mg/g)高于水提物中橄榄苦苷的含量(37.60±6.84 mg/g)。油橄榄叶的干燥方法及储存条件对橄榄苦苷提取率也有影响[15]。将油橄榄叶片经液氮研磨冷冻干燥、-20 ℃冷冻干燥或45 ℃烘干,得到油橄榄干叶片粉末,于-80、-20、4及25 ℃条件下储存,采用超声波提取法得到样品提取液,并使用HPLC测定提取液中橄榄苦苷含量。结果表明:采用45 ℃烘干的干燥方式、存储在25 ℃条件下的样品橄榄苦苷质量分数最高,达到77.9 mg/g。Lama-Muoz等[16]采用加压流体萃取技术从油橄榄叶中提取橄榄苦苷和木犀草苷的效率高于传统的动态浸渍技术。油橄榄叶经过热烫前处理技术使酶失活,经超声波进一步处理,有利于溶剂的传质,促进橄榄苦苷的释放[17]。

酶法辅助提取和水解处理油橄榄叶可以显著提高产品中活性成分的含量[18]。采用先酶解后超声波处理的提取方式,可以破坏油橄榄叶细胞壁结构,减小提取过程的传质阻力,提高多糖提取率(油橄榄叶多糖提取率为4.5%)[19]。羟基酪醇在油橄榄叶中主要以橄榄苦苷的形式存在,采用β-葡萄糖苷酶对橄榄苦苷进行水解,按照酶法最佳提取条件和大孔吸附树脂最佳分离纯化条件操作,羟基酪醇总油状物得率为3.85 mg/g,纯度为87.01%[2]。王强等[18]分析了7种酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的水解效果。其中β-葡萄糖苷酶的水解效果最好,半纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶次之,纤维素酶和碱性蛋白酶效果最差。经过酶水解后油橄榄叶提取物水解液的还原能力及清除DPPH的能力均高于VC和BHT。

1.2 油橄榄叶活性成分的分离纯化

以上方法得到的是油橄榄叶的粗提物,为更有效的利用油橄榄叶的有效成分,有必要进一步对其分离和纯化。李俊等[20]测定了9种大孔吸附树脂对油橄榄叶总黄酮的吸附特性,通过HPD-300型大孔吸附树脂,总黄酮吸附率可达到83.5%,总黄酮得率为10.19%。D-101型大孔树脂纯化后的橄榄苦苷经乙酸乙酯萃取后纯度可达63.43%[21]。此外,高速逆流色谱技术可以快速分离油橄榄叶中的橄榄苦苷,纯度可达到90%以上,为高效分离制备油橄榄叶橄榄苦苷提供了更有效的方法[5]。Liu等[22]利用填充床生物反应器内固定化酶技术,将油橄榄叶提取物中的橄榄苦苷转化为羟基酪醇,橄榄苦苷的降解率约为90%,羟基酪醇得率约为70%。载体珠分别选择了藻酸钙、壳聚糖纳米纤维及多孔陶瓷三种材料,其中,无机多孔陶瓷珠相对于有机载体成本更低,性能更好,更适合羟基酪醇的工业化生产。

为进一步对油橄榄叶提取物进行鉴定、量化和标准化,王晓杰等[23]对油橄榄叶中总多酚、总黄酮和橄榄苦苷热浸提工艺进行放大实验,得到提取液中的总多酚3.77 g/L、总黄酮2.85 g/L和橄榄苦苷3.03 g/L。并对脱除乙醇的提取液进行了喷雾干燥,运用AB-8大孔树脂对粗提物纯化,总多酚、总黄酮和橄榄苦苷质量分数分别从9.71%、7.22%和9.16%提高到31.65%、10.98%和20.38%,干燥后提取物粉末溶解度为9.38%。以上研究结果为油橄榄叶提取物进入保健食品行业提供了数据支持[23]。

油橄榄叶中的多酚类化合物结构及生理活性不同,如何有效地分离和纯化多酚类化合物是油橄榄叶得以应用的前提。鉴于传统提取分离纯化技术存在耗时、纯度低、溶剂回收率低等缺点,快速、规模化及回收率高的新型色谱分离技术将成为今后的研究重点。

2 油橄榄叶提取物的药理活性

油橄榄叶富含橄榄苦苷、木犀草苷、咖啡酸、芹菜苷、槲皮素和芦丁等多种酚类化合物,具有广泛的药理活性[24-26],可体现在抗氧化、对心脑肝肾等器官及骨骼的保护作用、降压降糖,同时还可改善自身免疫引发的炎症,起到抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用[1,27]。

2.1 肝损伤的修复作用

油橄榄叶醇提物的活性成分主要是酚类、裂环烯醚萜和木酚素类,研究者们针对油橄榄叶醇提物对肝损伤修复作用的物质基础及其主要功效成分进行了深入探讨[1]。王昱[28]分析了油橄榄叶提取物干预非酒精性脂肪肝的分子机制、对酒精性肝损伤大鼠肝组织转化生长因子-β1水平的影响。可能由于油橄榄叶醇提取物抑制氧化应激及炎症反应因子释放等,对D-半乳糖胺/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤起到了较好的保护作用[1]。

2.2 抗糖尿病作用

油橄榄叶醇提物还可以有效改善正常小鼠糖代谢和糖耐量,降低肾上腺素、四氧嘧啶及链脲佐菌素致糖尿病大鼠血糖,促进糖尿病大鼠分泌胰岛素,并具有保护肾脏、胰腺的作用[29-30]。其作用机制可能与油橄榄叶醇提物促进体内胰岛素分泌,増加机体对葡萄糖利用,减少肝内糖异生,抑制肝糖原分解,抗氧化以及减轻脂质过氧化反应对胰岛β细胞的损伤有关[29-30]。油橄榄叶提取物(500、250、125 mg/kg)可显著降低Ⅱ型糖尿病大鼠空腹血糖、降低胰岛素抵抗指数,升高胰岛素敏感指数;给药5周后,血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸、糖化血清蛋白含量降低,高密度脂蛋白胆固醇含量升高。可见油橄榄叶提取物在降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖、改善葡萄糖耐量及胰岛素耐量的同时,可以调节血脂代谢异常[31]。Guex等[32]研究得到了同样的结果,与对照组相比,油橄榄叶醇提物给药组的糖尿病大鼠体重显著下降,改善血糖含量,而且还可以减弱炎症和代谢标志物的水平。樊瑞娜[33]以其前期筛选得到的油橄榄叶降糖有效部位为研究对象,评价了其对糖代谢关键酶的抑制作用,同时利用逆流色谱法分离制备了降糖有效部位中的化合物,为以油橄榄叶为原料制备降糖新药提供了理论依据。

2.3 保护脑神经作用

油橄榄叶中橄榄苦苷对神经系统的作用也逐渐被关注,不仅能保护脑缺血再灌注损伤[34],还可降低As2O3对小鼠神经系统的毒性,其机制与影响大脑组织神经递质基因的表达有关[35]。橄榄苦苷干预后,As2O3致小鼠的神经毒性明显减轻,大脑组织乙酰胆碱、单胺类和氨基酸类神经递质代谢酶基因及各神经递质受体基因的表达水平与正常组差异不显著[35]。橄榄苦苷对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制细胞凋亡有关[36]。橄榄苦苷能够抑制H2O2诱导的PC12细胞的活力下降,降低PC12细胞的凋亡率,抑制PC12细胞内SOD及GSH-PX活力的降低,同时,橄榄苦苷可以抑制H2O2诱导的细胞凋亡蛋白Cyt-c、Caspase-3表达的上调[36]。

橄榄苦苷还可以通过增加大脑抗氧化酶的活性、降低脂质过氧化水平,从而改善阿尔茨海默病小鼠的学习记忆障碍[37]。胡光强等[38]研究表明:橄榄苦苷通过结合并抑制Aβ1-42纤维,降低Aβ1-42诱导的Neuro-2a的细胞毒性,提高细胞存活率,并预防Aβ1-42诱导的细胞凋亡。以上研究结果支持橄榄苦苷作为治疗阿尔茨海默病的潜在药物,但是橄榄苦苷在阿尔茨海默病治疗的机制还有待进一步探索。Shibani Farhad等[39]证实了橄榄苦苷可预防吗啡致大鼠空间学习障碍和记忆损伤,分子机制可能与其抑制了吗啡致大鼠海马CA1区神经元凋亡和氧化应激有关。

2.4 抗肿瘤及对骨骼和生殖系统的保护作用

橄榄苦苷是一种有效的抗癌化合物,能直接破坏细胞中的肌动蛋白微丝,抑制肿瘤细胞株的增殖和迁移,不可逆的包围癌细胞,阻止其复制、运动和侵袭[40]。有研究证明,橄榄苦苷可以抑制皮肤癌变和肿瘤的生长,可能与阻止血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶的表达有关[27];可以抑制甲状腺癌细胞增殖,可能与其抑制PI3K/Akt信号通路有关[41];可以抑制结直肠肿瘤的生长,可能与降低肠道相关IL-6、干扰素γ,TNF-α、IL-17A以及COX-2、Bax蛋白和增殖细胞核抗原蛋白的表达,下调NF-KB、Wnt/β、PI3K/Akt信号转导以及转录激活因子3(STAT3)的表达有关[42]。Sepideh等[43]研究表明,250和500 mg/kg的油橄榄叶提取物口服剂量可以改进白消安引起的小鼠睾丸、精子质量及睾丸生殖细胞凋亡的损伤,但是750 mg/kg的高剂量却加剧了该损伤。

橄榄苦苷能有效地减少牙槽骨质丢失,可能是因为橄榄苦苷降低了破骨细胞活性、炎症以及细胞的凋亡,同时增加了成骨细胞活性[44]。400、200、100 μg/mL橄榄苦苷对破骨细胞的增殖具有明显抑制作用,作用机制可能是橄榄苦苷破坏了破骨细胞细胞膜的完整性[45]。

橄榄苦苷不仅可以减少骨量丢失、防治骨质疏松[46],还具有抗子宫内膜癌和乳腺癌等作用,已成为预防和治疗妇科恶性肿瘤的理想药物。橄榄苦苷通过协调人乳腺癌细胞MCF-7中表观遗传调控因素与组蛋白去乙酰化酶,显著降低MCF-7的侵袭性和细胞活力,抑制细胞增殖,同时诱导MCF-7细胞凋亡[47-48]。橄榄苦苷可通过抑制炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的合成和释放,减轻辐射诱导的炎症反应,减轻卵巢的辐射性损伤[49]。许玉黎等[27]课题组体外实验已证实橄榄苦苷可抑制卵巢癌SKOV3细胞的的增殖,且抑制作用呈现浓度依赖性。又进一步研究发现橄榄苦苷可能通过抑制抗凋亡因子Bcl-2的表达、增强凋亡促进因子Bax的表达,从而对卵巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有抑制作用。

油橄榄叶提取物具有修复肝损伤、降糖、保护脑神经的作用,是具有潜在应用前景的降糖、辅助抗乳腺癌和卵巢癌新药,其作用机制和临床疗效尚有待进一步验证。

3 油橄榄叶的其他增值加工利用

3.1 油橄榄叶应用于食品加工

在地中海沿岸国家,油橄榄叶既作为传统草药治疗疾病,还可作为普通食品食用[6]或做为膳食补充剂,现代植物疗法使用油橄榄叶降血压,并可作为利尿剂[26]。国内也有一些研究将油橄榄叶制成保健茶、油橄榄叶挂面[18]、油橄榄叶造纸,或将油橄榄叶水提取物作为还原剂和稳定剂合成银纳米颗粒[20,50]。李戴阳[51]通过黑曲霉麸曲和红曲米的联合发酵技术研制具有良好营养价值的油橄榄叶黑茶,其外形规整,润泽度好;茶汤呈红浓色,香气浓郁,滋味醇厚。方成鑫等[52]研究了西昌产5个品种油橄榄茶的黄酮类及多酚类成分,油橄榄茶中橄榄苦苷含量高,VE含量相对较低。也有研究分析了云南永仁27个品种的油橄榄叶茶的锌、铁、铜等矿物质元素含量,为云南油橄榄高值化产品的开发提供一定的理论基础[53]。

李春燕[2]在研究了油橄榄叶中羟基酪醇的提取分离纯化后,又进一步优化了油橄榄叶酒最佳酿造工艺为:添加4%酵母在初始糖度10%、初始pH为3.6、主发酵温度25 ℃的条件下发酵6 d。橄榄酒具有油橄榄的特殊风味,且酒体良好,无沉淀,滋味纯正。马腾臻等[54]以制取橄榄油后的果汁为原料,通过调配、发酵等工艺制得油橄榄酒,并鉴定出69种香气成分,总含量约23.44 mg/L,主要香气成分有香叶醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈创木酚。该方法在继油橄榄枝叶和果渣中有效成分的提取后进一步完善了油橄榄综合开发利用体系。

3.2 油橄榄叶提取物应用于食品贮藏保鲜

油橄榄叶提取物还可用于食品及农产品的贮藏保鲜。Khalifa等[55-56]将油橄榄叶提取物及果渣提取物添加到壳聚糖保鲜膜中,应用到苹果和草莓的贮藏。该保鲜膜有效抑制了扩展青霉和匍枝根霉的生长繁殖,有效降低了苹果和草莓的腐烂率。其中,壳聚糖与2%油橄榄叶提取物复合涂膜有效的降低了苹果在储藏期间的失重率。Amaro-Blanco等[57]将添加了油橄榄叶提取物的活性包装结合真空处理,应用于伊比利亚腌制猪肩肉的保藏,起到了很好的保藏效果。油橄榄叶提取物橄榄苦苷对核桃油也有较强的抗氧化和清除自由基的能力,将265 mg/kg橄榄苦苷、135 mg/kg柠檬酸和197 mg/kg VC复配,对核桃油的抗氧化稳定性有较好的增效作用[58]。

4 结语

油橄榄叶中富含的天然活性成分具有广阔的前景,可应用于药品、化妆品、保健食品和功能性食品[59]。目前,油橄榄叶提取物的研究和利用水平仍不充分,后续可从以下几方面进行研究:油橄榄叶提取物的高效提取工艺和稳定性研究[60];油橄榄叶提取物的分离纯化和结构鉴定;油橄榄叶提取物多种活性成分的协同作用[26],药理活性的作用机制和临床疗效尚有待进一步探究;进行油橄榄叶提取物相关功能性产品的开发应用。随着研究的深入,油橄榄叶提取物的保健功能将得到充分发挥,油橄榄叶也能得到更加完善的利用。