三七冻干粉及其活性组分对小鼠1型辅助性T细胞分化和活性的影响

张明菲,范瑶婕,杨 培,王 祥,周玲玲

(南京中医药大学药学院,江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京 210023)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)在临床实践中是一种宝贵的中草药[1],微苦、药性温和,具有止血、消除疲劳、消肿止痛等功效。随着医学模式从治疗医学向预防医学的转变,三七越来越多的生物活性功效被人们所知晓,因此频繁地被应用于保健食品领域[2]。1994年美国膳食补充剂健康与教育法将三七列为膳食补充剂[3]。在中国,三七被列入到卫生部“可用于保健食品的物品名单”中,从2002年起开始应用于保健食品[4]。

目前,国家食品药品监督管理局公布的保健食品中含有三七的产品有60多种,涉及多种保健功能,现代研究表明,三七在血液系统,心血管系统,神经系统,免疫系统等多方面具有生物活性[5-7]。现代药理研究表明,自身免疫病、糖尿病等多种疾病均与免疫因素相关。CD4+辅助性T细胞(T helper,Th)是机体适应性免疫细胞,其可分化成Th1、Th2、Treg、Th17等不同的亚群,调控细胞和体液免疫应答过程[8]。其中Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18和其他细胞因子[8-9],可以有效地刺激细胞免疫反应和迟发型变态反应(DTH),与多种原因所致的炎症反应密切相关,被称为炎症性T细胞。有研究发现,三七的主要活性组分三七总皂苷(Panaxnotoginsengsaponins,PNS)可以抑制类风湿性关节炎患者Th1细胞分泌细胞因子IFN-γ[10-12],因此三七对Th1细胞分化和活性的影响值得进一步研究。

本研究体外培养小鼠CD4+T细胞,将三七制备成三七冻干粉(Sanqi,SQ)用于细胞给药,同时采用三七中主要活性组分PNS,观察两者对Th1分泌的IFN-γ表达水平及Th1特征性因子T-bet表达的影响,明确其对Th1细胞分化和活性的影响。为进一步明确三七调节免疫的作用机制和物质基础提供依据,指导其作为药品和保健食品的科学应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小鼠 C57BL/6雄性小鼠15只,SPF级,6～8周龄,来自南京江宁青龙山动物繁殖场,动物合格证:SYXK(苏)2017-0001;三七生药 安徽亳州中药饮片厂,经鉴定都符合2015版《中国药典》一部中的相关规定;三七总皂苷(PNS) 南京景竹生物科技有限公司(货号:JZ15101407,纯度85%);刀豆蛋白A(ConA) Sigma公司;红细胞裂解液 碧云天(批号20190215);Trizol 美国Life Technologies公司(批号79403);CD4+T细胞分选磁珠 美国BD公司(批号8129931);IFN-γELISA试剂盒 联科生物(批号A280H90242)。

超微量紫外-可见光分光光度计 Thermo ScientificTMNanoDropTMOne;倒置显微镜 日本尼康公司;7500型荧光定量PCR仪 美国ABI公司;5417R型低温离心机 德国Eppendorf公司;SyneRgy 2型多功能酶标仪 美国BioTek公司;提取机组 山东青州市精诚医药装备制造有限公司;真空冷冻干燥机 美国LABCONCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 三七冻干粉的制备 取三七生药1000.00 g,加入10 L水浸泡4 h。将三七浸泡液加入提取机组(80 ℃,负压)提取,计量冷凝水体积,直至只剩1 L水液,取出。将水提液倒入冷冻盘,放入-80 ℃冰箱冷冻过夜。将冷冻盘放入真空冷冻干燥机,干燥48 h直至呈粉末状。收集冻干粉133.56 g(产率为13.36%),密封保存,放入干燥剂,置于干燥处备用。

1.2.2 细胞分组及给药 脱颈处死C57BL/6小鼠,浸泡于含有75%乙醇的烧杯中15 min,在无菌条件下,取出脾脏,研磨并使用红细胞裂解液获得白细胞,磁珠分选出CD4+T细胞。取生长状态良好的CD4+T细胞,每孔加入1×105个细胞,设置空白对照组(RPMI-1640完全培养基和细胞)以及不同浓度的给药组:三七冻干粉组(80、160、320、640 μg/mL)和三七总皂苷组(5、10、20、40 μg/mL)。

1.2.3 CCK-8法检测细胞活力 将不同浓度的SQ和PNS分别作用于细胞,并设置空白组(仅RPMI-1640完全培养基)和对照组(RPMI-1640完全培养基和细胞)以及分别设置5组平行对照(n=5),培养48 h后每孔加入20 μL增强型CCK-8溶液,继续于37 ℃孵育1 h,用酶标仪检测450 nm处吸光度(A),并计算细胞活力,筛选出合适的给药浓度。

1.2.4 上清中IFN-γ检测 按“1.2.2”项下分组给药将细胞培养48 h后,分离出上清液,使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定上清液中IFN-γ的水平,严格按ELISA试剂盒说明书操作,并分别于450和570 nm处测OD值,计算出对应的IFN-γ浓度。

1.2.5 q-PCR检测IFN-γmRNA、T-bet mRNA表达水平 按“1.2.2”项下分组给药将细胞培养48 h后,使用Trizol法提取细胞RNA,严格按照操作说明书应用q-PCR法检测IFN-γ和T-bet mRNA的相对表达量,结果用2-ΔΔCt表示。以GAPDH为内参。引物根据Primer5.0引物设计软件设计,再由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列如下表1。

表1 q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR detection

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 8.0 软件对结果进行统计分析和作图,采用方差分析比较差异,若P<0.05,则表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 三七冻干粉和PNS对CD4+T细胞活力的影响

CCK8法是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖的快速、高灵敏度检测的方法[13-15]。本研究选用CCK8法检测细胞活性,筛选出最佳给药浓度。结果如图1所示,不同浓度的SQ和PNS对CD4+T细胞作用48 h后,与对照组比较,发现SQ的质量浓度为160、320、640 μg/mL时,其对CD4+T细胞活力无明显影响(图1A),CD4+T细胞分为多种亚群[8],本研究主要观察药物对CD4+T细胞向Th1细胞方向分化的影响,因此采用CCK8方法筛选出对CD4+T细胞活力无明显影响的浓度进行后续的研究。而当SQ浓度为80 μg/mL时,其对CD4+T细胞有显著抑制作用,故而不选择该浓度而选择160、320、640 μg/mL作为后续实验的给药浓度。当PNS的质量浓度为5、10、20、40 μg/mL对CD4+T细胞活力均无明显影响,结合PNS在三七中的比例,因此在本实验中选择5、10、20 μg/mL作为后续实验的给药浓度(图1B)。

图1 SQ和PNS对CD4+T细胞活力的影响Fig.1 Effect of SQ and PNS on viability of CD4+T cell注:与对照组比较:*P<0.05。

2.2 SQ和PNS对细胞上清中IFN-γ水平的影响

Th1细胞能够分泌大量的细胞因子IFN-γ[16],通过IFN-γ的含量可以反应Th1细胞的分泌活性。结果如图2所示,与对照组比较,SQ和PNS都能显著降低IFN-γ表达的水平(P<0.05)。IFN-γ主要由Th1细胞分泌,大量的研究均使用细胞上清中IFN-γ水平变化来表明Th1细胞分化的变化[17-18],提示SQ和PNS均能显著抑制Th1细胞分泌IFN-γ的功能从而调节免疫平衡。

图2 SQ和PNS对IFN-γ水平的影响Fig.2 Effect of SQ and PNS on expression of IFN-γ注:与对照组比较:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

2.3 SQ和PNS对IFN-γ mRNA、T-bet mRNA表达水平的影响

T-bet是Th1细胞的重要转录调节因子[19],故通过测定T-bet的表达可反映分化为Th1细胞亚群的比例。结果如图3所示,与对照组比较,SQ和PNS均能够显著降低与Th1细胞相关的T-bet mRNA表达水平。T-bet是驱动Th1细胞分化的主转录因子[20],本实验结果显示T-bet表达水平的下降提示SQ和PNS可明显抑制CD4+T细胞向Th1分化的比例。

Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ的mRNA水平变化反映Th1细胞活性的变化[21],结果如图3所示,SQ和PNS可明显抑制IFN-γ的mRNA水平,Th1细胞中IFN-γmRNA经翻译过程可形成IFN-γ并分泌到胞外,提示二者均可抑制Th1细胞分泌细胞因子的活性。

图3 SQ和PNS对T-bet和IFN-γ mRNA表达的影响Fig.3 Effect of SQ and PNS on expression ofIFN-γ mRNA and T-bet mRNA注:与对照组比较:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001。

3 讨论与结论

Th1细胞是一种效应T细胞,具有免疫调节作用,Th1细胞与其他Th细胞亚型处于动态平衡状态,该状态一旦失衡可引起免疫调节紊乱,Th1细胞异常活化可引起感染,自身免疫性疾病等[22-23]。类风湿性关节炎(RA)是目前常见的自身免疫性疾病,大量研究表明Th1细胞及其分泌的细胞因子过量是重要的致病因素[24-26]。本实验使用CCK8法筛选出不影响CD4+T细胞活性的最佳药物浓度,在后续实验中探讨SQ和PNS对CD4+T细胞向Th1细胞分化的影响。T-bet是Th1细胞特征性转录因子,IFN-γ是Th1细胞分泌的特征性细胞因子,因此二者可以分别反映CD4+T细胞分化为Th1亚群的比例和Th1细胞的分泌活性。本研究结果显示:不同浓度的SQ及其活性组分PNS可抑制IFN-γ水平和IFN-γmRNA与T-bet mRNA,提示二者均可抑制Th1细胞的分化和活性。随着SQ浓度升高,Th1细胞分泌IFN-γ的活性以及该细胞中IFN-γmRNA的表达水平均被显著抑制,但二者呈现出相反的趋势,前者抑制作用表现为剂量依赖性减弱,而后者表现为剂量依赖性增强,这可能是翻译和转录过程中某一环节受到影响,其潜在的机制有待探讨。Wei等[11]发现经PNS处理后,细胞因子IFN-γ的表达水平显著下降。本研究结果与其一致,但本实验是根据PNS在三七中的含量设置的浓度,相比较Wei等[11]的研究浓度范围更窄。随着PNS的浓度升高,Th1细胞分泌IFN-γ的活性以及该细胞中IFN-γmRNA的表达水平均呈剂量依赖性的被抑制,且二者趋势一致。Th1细胞为促炎细胞,其主要分泌IFN-γ,本研究恰好说明了三七能够抑制Th1细胞分泌IFN-γ的活性来发挥调节免疫的作用,提示其在RA中抑制异常活化的Th1细胞,有助于机体恢复免疫平衡。

目前已经有大量文献证明转录因子是某些细胞发育和功能作用的关键因子。T-bet被认为是Th1细胞分化的主转录因子,因此也被认为是Th1细胞的标记物。它是由Szabo等[27]于2000年最初发现其可以推动Th0前体细胞向Th1细胞分化发育,并可显著地提高细胞IFN-γ的表达水平。T-bet的表达依赖于STAT1信号(signal transducer and activator of transcription,信号转导和转录激活因子),并可由正反馈周期介导(取决于其下游主要靶分子IFN-γ的直接作用),迅速增强其表达[28]。除了IFN-γ之外,其他蛋白质也在Th1细胞的免疫生物学中具有重要作用,包括STAT1,IL-12Rβ2,CC-趋化因子配体3(CCL3)和CXC-趋化因子受体3(CXCR3),而T-bet可以与编码这些蛋白质的基因的启动子区域结合干预转录过程[29]。因此,T-bet在Th1细胞的发育分化过程中起着重要的作用。本研究结果表明SQ和PNS均能显著的抑制T-bet mRNA的水平,并且该抑制效果呈剂量依赖性,因此三七能够有效抑制Th1细胞分化过程中重要的转录因子,从而抑制CD4+T细胞向Th1方向的分化,该作用可能与三七调节免疫平衡有关。

综上所述,为了进一步明确三七调节免疫的机制,鉴于Th1细胞在免疫调节中的重要作用,本实验观察了三七和其主要活性组分PNS对Th1细胞活力、IFN-γ水平、IFN-γmRNA、T-bet mRNA表达的影响。结果表明,一定浓度的SQ及PNS可明显抑制Th1特征性因子T-bet的表达,抑制CD4+T细胞向Th1方向的分化;其可抑制细胞IFN-γmRNA的表达,降低上清中IFN-γ的水平,提示其可抑制Th1细胞分泌细胞因子的活性,从而对免疫系统产生调节作用。上述研究结果表明,三七及其活性组分可以抑制CD4+T细胞向Th1方向的分化和Th1细胞的分泌活性,这可能是其调节机体免疫平衡的机制之一,从而防治炎症免疫相关性疾病和亚健康状态,这可为三七在日常保健和治疗疾病中的合理应用提供依据。