超声波辅助提取紫槐花色素工艺优化

徐文秀,刘 俊

(运城学院生命科学系,山西运城 044000)

紫槐,又名红花洋槐(RobiniapseudoacaciaL.),属豆科蝶形花亚科刺槐属植物,为刺槐变种,因其花穗硕大,花期长而艳丽,是园林常用的观赏树种之一。紫槐有一定的抗旱能力,对土壤适应性强,广泛分布于我国南北各地[1-2]。紫槐苗木主要依靠刺槐砧嫁接繁育而来,研究主要集中在嫁接技术[3-4]、组织培养及快速繁殖[5]方面。目前,对紫槐利用研究报道主要集中在紫槐叶营养成分分析及紫槐花色素提取及稳定性研究方面[6-7]。通过过前期查阅资料及预实验结果,推测紫槐花色素属于花青素类物质。

花青素(Anthocyanidin),又称花色素,是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,属类黄酮化合物。花青素是一种强有力的抗氧化剂,它能够保护人体免受自由基的损伤。花青素还能够增强血管弹性,改善循环系统和增进皮肤的光滑度,抑制炎症和过敏,改善关节的柔韧性。目前,花青素含量测定方法有以下四种:单一pH法、差减法、pH示差法[8-10]和高效液相色谱法。单一pH法和差减法虽然操作简便,但是其准确度却比较低,目前较少使用[11-12]。高效液相色谱法适用于分析样品中不同种类花青素的含量,准确率较高,但需要有标物才能定性样品,而且设备和标品成本较为昂贵,限制了本方法应用[13]。同前三种方法相比,pH示差法所需设备相对简单,准确性好,适用于对未知结构花青素类物质含量测定[14-16]。目前pH示差法已测定黑枸杞[12,14]、茄子皮[17]、红菊苣[18]、蓝莓[19]、各种颜色的花[20]、无花果皮[21]、紫苏叶[22]等原料中花青素含量。但还未见运用pH示差法对紫槐花花青素进行测定的相关报道。

同传统溶液提取法相比,利用超声波技术辅助提取可以强化提取分离过程,可有效提高提取分离率,缩短提取时间、节约成本、甚至还可以提高产品的质量和产量。本研究采用超声波辅助提取,利用pH示差法对红花刺槐色素产量进行测定。研究紫槐花中提取色素最佳工艺,以期为紫槐花色素的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫槐花 采自运城学院校区,花苞饱满未开放时采摘,干燥后密封包装置于避光处保存,待用;柠檬酸 天津市瑞金特化学品有限公司;KCl 天津市瑞金特化学品有限公司;盐酸 洛阳昊华化学试剂有限公司;NaAc 天津市大茂化学试剂厂;以上试剂均为分析纯。

UV6000PC紫外可见分光光度计 西安比诺仪器设备有限公司;TP213电子天平 海舜宇恒平科学仪器有限公司;SHZ-Ⅲ循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫槐花色素提取工艺优化

1.2.1.1 紫槐花色素最大吸收波长的确定 准确称取1.00 g干燥紫槐花,加入50 mL 0.1%柠檬酸溶液,60 ℃,300 W超声波提取20 min,抽滤得滤液。用紫外可见分光光度计,在波长220～760 nm扫描,确定紫槐花色素液最大吸收波长。

1.2.1.2 最佳提取剂的确定 称取1.0 g紫槐花6份,分别加入100 mL 0.1%柠檬酸、0.1%盐酸、0.1%硫酸、95%酸乙醇、乙醚、石油醚,于60 ℃,300 W超声提取20 min,抽滤得滤液,取2 mL滤液用pH=1、4.5的缓冲液分别定容至20 mL,避光静置1 h后两组待测液,用紫外可见分光光度计分别测其波长在在520 nm及700 nm处吸光值,计算其中色素含量,确定最佳提取溶剂。

1.2.1.3 提取溶剂最佳pH确定 精确称取6份1 g样品,分别加入50 mL pH=1、2、3、4、5、6的柠檬酸水溶液,用保鲜膜封口,60 ℃,300 W超声提取20 min,抽滤得滤液,取4 mL滤液用pH=1、4.5的缓冲液分别定容至20 mL,避光静置1 h后两组待测液用紫外可见分光光度计分别测其波长在在520 nm及700 nm处吸光值,计算其中色素含量,确定提取溶剂最佳pH。

1.2.1.4 紫槐花色素提取单因素实验 称取一定量紫槐花干燥品,固定液料比50∶1 mL/g,超声功率300 W,提取时间30 min,考察不同温度(30、40、50、60、70、80 ℃)对紫槐花提取液中色素含量的影响;固定液料比50∶1 mL/g、超声功率300 W,提取温度60 ℃,考察不同提取时间(5、10、15、20、25、30 min)对紫槐花提取液中色素含量的影响;固定提取时间30 min、提取温度60 ℃,超声功率300 W,考察不同液料比(30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1 mL/g)对紫槐花提取液中色素含量的影响;固定提取时间30 min、提取温度60 ℃,液料比50∶1 g/mL,考察超声功率(200、250、300、350、400、450 W)对紫槐花提取液中色素含量的影响。

1.2.1.5 紫槐花色素提取响应面实验 在单因素实验的基础上,选取料液比、超声时间和超声功率3个因素采用Box-Behnken中心试验组合设计实验方案,以提取液中色素含量为指标,优化提取工艺参数,实验因素水平表如表1所示。

表1 实验设计Table 1 Design of factors and levles

1.2.2 提取次数对色素提取的影响 称取一定量新鲜样品,按上述方法得到的最佳提取工艺参数超声提取色素,提取完成后分离滤渣和提取液,滤渣再按相同条件提取,再次抽滤分离滤渣及滤液,反复4次。每次所得提取液,用pH示差法测其色素含量,确定最佳提取次数。

1.3 色素含量测定方法

经查阅文献[20-22],色素含量采用pH示差法进行测定。具体操作如下:

pH1.0 缓冲液:配制浓度为0.2 mol/L KCl溶液;配制0.2 mol/L盐酸溶液;以25∶76的体积比混合,再用KCl溶液调pH至1.0±0.1。

pH4.5缓冲液:配制浓度为0.2 mol/L NaAc溶液,用盐酸调pH至4.5±0.1。

从滤液中移取2 mL待测液于20 mL比色瓶中,分别用pH=1.0、pH=4.5的缓冲溶液定容,在30 ℃水浴中反应平衡30 min。以蒸馏水作为空白对照,用紫外分光光度计测定花青素在520和700 nm处的吸光值,以矢车菊-3-葡萄糖苷计,利用Fuleki公式对待测液中花青素含量进行测定[23]。

ΔA=(A520 nm-A700 nm)pH=1.0-(A520 nm-A700 nm)pH=4.5

式(1)

式中,ΔA-紫槐花色素总吸光值;A520 nm-紫槐花色素在520 nm处的吸光值;A700 nm-紫槐花色素在700 nm处的吸光值;c-紫槐花色素质量分数(mg/100 g);V-提取液总体积(mL);DF-稀释倍数;M-Cy-3-Glu(矢车菊-3-葡萄糖苷)的相对分子质量(449.2 g/mol);ε-Cy-3-Glu(矢车菊-3-葡萄糖苷)的消光系数(29600 L·mol-1·cm-1);m-样品质量(g);L-光程,数值为1 cm。

1.4 紫槐花色素红外光谱特征

色素红外光谱特征分析采用溴化钾压片法。先称取150 mg溴化钾,将其放入玛瑙钵中研成细粉末。再称取1.5 mg紫槐色素纯品粉末加入其中研磨,使二者充分混匀磨细,从而进行压片。在400～3600 cm-1范围内测其红外吸收光谱,并进行分析[24]。

1.5 数据处理

为了保证实验精确度,每个水平进行三组平行实验,结果取平均值。采用Excel 2003软件进行数据分析及绘图,采用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Benhnken中心组合响应面设计及方差分析。

2 结果与分析

2.1 紫槐花色素提取液最大波长确定

根据图1可得知,紫槐花色素液在220～760 nm波长范围扫描时,有三个峰,分别为280、340、538 nm,其中280、538 nm峰符合花青素特征波长[24];所以可以用pH示差法对其含量进行测定。

图1 紫槐花色素最大波长的确定Fig.1 Determination of the maximum wavelength of pigment

2.2 紫槐花色素最佳溶剂的确定

根据图2可知,0.1%柠檬酸提取紫槐花效果最好,其次是0.1%盐酸、95%酸乙醇、0.1%硫酸,乙醚很少溶出、石油醚基本不溶,从图中可知用柠檬酸提取效果更好,所以后续实验选用柠檬酸溶液做提取溶剂。

图2 紫槐花色素最佳溶剂的确定Fig.2 Determination of the best solvent of pigment

2.3 提取溶剂最佳pH确定

根据图3可得:柠檬酸溶剂pH对于紫槐花色素量的影响:pH<2之前呈上升状态,pH=2时色素提取量达最大值。pH>2后色素提取量急剧下降,最后趋于平稳。由此紫槐花色素提取时,提取溶剂pH=2最佳。

图3 紫槐花提取色素溶剂最佳pH的确定Fig.3 Determination of the best pH vaule of extraction solvent

2.4 单因素试验结果

2.4.1 提取温度对提取液中色素含量的影响 由图4可知:温度低于60 ℃时,色素含量随温度的升高而上升,因为温度升高,物质分子溶解和扩散的速度都会加快;温度高于60 ℃,色素含量就会下降。这可能是温度过高使色素降解所致[24]。

图4 提取温度对紫槐色素提取的影响Fig.4 Effect of temperature on pigment extraction

2.4.2 提取时间对提取液中色素含量的影响 由图5可知,随着提取时间的延长,色素含量上升,当提取时间为20 min时,色素含量最高,继续延长提取时间,色素含量下降明显;原因可能是色素在该温度下时间过长,导致色素结构变化,失去原来的理化性质,从而使色素含量下降[24]。

图5 提取时间对紫槐色素提取的影响Fig.5 Effect of time on pigment extraction

2.4.3 液料比对提取液中色素含量的影响 由图6可知,色素含量会随提取液用量增大而上升,当液料比达到50∶1 g/mL时,色素提取量最高。随后,提取溶剂用量增加,色素提取量下降,但下降幅度不大,曲线趋于平稳,原因可能是随着液料比的增加,紫槐花与提取溶剂的接触面增加,色素类物质向溶剂溶出的阻力减小,使得提取液中溶解的色素含量增加;当液料比达到一定值时,色素中的有效成分基本溶出,传质推动力减小,提取量有所降低[25]。

图6 液料比对紫槐色素提取的影响Fig.6 Effect of liquid to materialratio on pigment extraction

2.4.4 超声功率对提取液中色素含量的影响 由图7可知,功率在200～300 W内,色素含量随功率提高逐渐增大。这是因为超声波在媒质中传播时可产生空化现象,空化中产生的极大压力造成被破碎物在瞬间破碎,同时,超声波产生的振动作用加强了被破碎物的扩散及溶解。功率加大,空化及机械作用以增大物分子运动频率和速率,从而增加溶剂穿透力,提高紫槐花色素的溶出[19]。功率大于300 W,色素含量降低。可能原因是:超声波频率过大,作用过程中媒质升温过高,导致色素发生降解[22]。由此可得,超声波提取紫槐花色素温度最佳功率为300 W。

图7 超声功率对紫槐色素提取的影响Fig.7 Effect of ultrasonic wavepower on pigment extraction

2.5 响应面试验结果与分析

根据Box-behnken组合原理设计实验,实验结果如表2所示。

表2 实验结果Table 2 The result of tests

2.5.1 模型建立与显著性分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对表2结果进行二次多元回归拟合,得到的紫槐花色素提取量(Y,mg/100 g)对自变量料液比,超声时间,超声功率的二次多项回归方程如下:

Y=118.25-0.47A+3.84B-14.07C+1.95AB+2.30AC-0.43BC-18.88A2-25.5B2-22.78C2

各因素方差分析如表3所示。由表可知:模型P<0.0001,表明该程模型达到极显著水平,失拟项P=0.0739>0.05,表明该回归模型与实验结果吻合度高。所以,此回归模型成立。可以分析和预测提取紫槐花色素含量的结果。超声功率P<0.01,表明超声功率对提取液中色素含量影响极显著,而液料比、提取时间P>0.05,说明这两因素对提取液中色素含量影响不显著。各因素对紫槐色素提取影响大小依次为:超声波功率(C)>超声波时间(B)>液料比(A)。二次项A2、B2、C2影响极显著。交互项影响不显著。

表3 响应面试验方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment

2.5.2 响应面结果分析 由图8可得,当料液比固定时,紫槐花提取液中色素含量会随超声波时间的延长而不断升高,直到20 min后色素含量开始下降;当超声波时间固定时,在液料比<50∶1 mL/g时色素含量不断增大,料液比>50∶1 mL/g后色素含量降低。

图8 液料比与提取时间对紫槐花色素含量的影响Fig.8 The effect of ratio of liquid to material and extraction time on the pigment yield

通过响应面及等高线图可以直观的看到3个变量(液料比、提取时间、提取功率)对色素含量的影响及3个变量之间的交互作用。3个变量之间的交互作用均不显著。通过图8～图10等高线图确定液料比的最佳水平范围为45～55 mL/g,提取时间最佳水平范围为19～21 min提取功率最佳水平范围为275～300 W。对回归方程求解,得到当液料比49.72∶1 mL/g,提取时间为20.38 min,超声功率为284.44 W时,紫槐花提取液中色素含量预测值为120.594 mg/100 g。

图9 液料比与提取功率对紫槐花色素含量的影响Fig.9 The effect of ratio of liquid to material and ultrasonic wave power on the pigment yield

图10 提取时间与超声功率对紫槐花色素含量的影响Fig.10 The effect of extraction time and ultrasonic wave power on the pigment yield

2.5.3 最佳工艺平行验证试验 利用Design-expert软件Box-Behnken设计原理对紫槐花色素提取条件进行正交设计,响应面法预测最佳紫槐花色素提取方案为:采用溶剂为pH=2的柠檬酸溶液,提取温度为60 ℃,理论液料比49.72∶1 mL/g,理论提取时间为20.38 min,理论超声功率为284.44 W。在以上条件下,紫槐花提取液中色素含量预测值为120.594 mg/100 g。采取以上理论预测的紫槐花色素提取最优条件进行实验验证,考虑到实际情况,将紫槐花色素提取最优条件改为液料比50∶1 mL/g,提取功率为300 W,提取时间为20 min。以上相同条件下进行3组平行实验,测出紫槐花提取液中色素含量值,取三组平均值,为118.77 mg/100 g。结果表明:实际值与响应面优化设计的预测值相差很小,此响应面法优化紫槐花色素提取工艺条件是可行的。

2.6 提取次数对色素得率影响结果分析

根据图11可知:随着提取次数的增加色素提取越来越完全。经测定得出:两次提取后,滤渣中剩余的色素含量已经较低。三次提取后,滤渣之中的色素含量已经非常少,滤渣颜色呈透明色;四次提取后,提取液中色素含量接近为0。综上所述选取提取次数为三次最为合理。

图11 提取次数对紫槐色素提取的影响Fig.11 Effect of extraction times on pigment

2.7 紫槐花色素红外光谱特征分析

如图12所示,紫槐色素红外光谱主要波数有1143、1705、1756、3289、3496 cm-1。其中,1143 cm-1为C-O-C伸缩吸收峰,这可能是花青素结构中吡喃环的结构。1705、1756 cm-1为杂环中羰基C=O的振动吸收峰,是判断羰基C=O(酮类、酸类、酯类、酸酐等)伸缩的特征频率。3248、3496 cm-1为羟基O-H伸缩振动吸收峰,说明结构有醇类、酚类或者有机酸。紫槐色素主要吸收有羰基、含氧杂环、羟基等结构,因此,推测属于花青素类物质[24]。

图12 红外光谱图Fig.12 Infrared spectra of pigment

3 结论

响应面试验确定提取紫槐花色素的最佳工艺条件:最佳提取剂为pH=2柠檬酸水溶液,液料比为50∶1 mL/g,提取温度60 ℃,提取时间20 min,超声功率300 W,在此条件下,提取液中色素含量为118.77 mg/100 g。影响色素提取因素的大小依次为:超声功率>超声时间>液料比。提取三次基本上可以将紫槐花中色素提取完全。经紫外可见光扫描最大吸收波长及红外光谱分析,推测紫槐色素主要成分为花青素类物质。但扫描结果显示提取物中存在黄酮类成分。深入研究紫槐花色素稳定性时需要将其中黄酮类成分去除。本研究测定色素含量时是以常见的矢车菊-3-葡萄糖苷计的,下一步研究应对紫槐花中花青素种类及糖苷中糖的种类进行深入分析,为今后更好利用紫槐花资源提供理论依据。