响应面法优化产β-内酰胺酶菌Bacillus cereus B03的发酵条件

陈 成,宁喜斌,2,3,4,*

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306; 2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306; 3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海 201306; 4.国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海),上海 201306)

《中华人民共和国药典》对β-内酰胺酶定义为:能裂解青霉素和头孢菌素类抗生素的β-内酰胺环,使其灭活的水解酶称为β-内酰胺酶[1]。随着核苷酸序列信息的增多,已鉴定的β-内酰胺酶的数量已接近指数增长,β-内酰胺酶数据库含有超过4300种经过不同程度表征的酶[2-3]。β-内酰胺类抗生素由于药效快、作用范围广、毒性低等优点,已被广泛应用在食品加工、畜牧饲养和水产养殖等与人类生活息息相关的各个领域。β-内酰胺酶因其具有水解β-内酰胺类抗生素中β-内酰胺环的特点,不仅应用在前药的开发与抗体定向酶前药治疗领域,也可与生物传感器、ELISA检测等结合检测乳及乳制品中残留的抗生素[4-7]。β-内酰胺酶不仅可以清除医疗器械、环境中抗生素的残留,也用于食品(特别是乳及乳制品)、饮用水和环境中残留抗生素的检测,为食品安全及公众健康提供重要的保障。

目前,国内报道的关于此类酶的培养基优化方面,都是单因素试验和正交优化试验的结合,还未见有关响应面法优化的报道[8-10]。响应面方法(RSM)结合了统计和数学技术,是基于经验模型与实验设计相关的实验数据的拟合,通过使用从适当设计的实验中获得的定量数据来优化提取过程[11-12]。岳喜庆等[13]采用单因素试验和正交试验对霍氏肠杆菌WM1产青霉素酶的培养基条件进行了优化,得到的产酶活力最高为1.15×104U/(mL·h)。魏宝东等[8]通过单因素试验和正交试验优化大肠杆菌产β-内酰胺酶发酵培养基组成,β-内酰胺酶活力达到2648.95 nkat,比优化前提高了18%。国内报道的产β-内酰胺酶菌株存在产酶量较低的问题,且单因素试验无法得知各因素之间的交互影响,正交试验只能得到最佳因素水平组合,而响应面法则可更为合理的以有效、经济的方式设计实验方案,考虑实验的随机误差,对实验分析更加全面[14]。

本研究在前期菌株筛选的基础上,结合单因素实验、Plackett-Burman设计以及Box-Behnken中心组合试验三种优化方法,旨在快速高效地提高菌株BacilluscereusB03的产酶能力,以期为进一步工业化开发利用性状稳定且高产β-内酰胺酶的菌株提供借鉴,为工业生产β-内酰胺酶及其应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株BacilluscereusB03 由实验室前期于上海市第六人民医院(临港地区)分离筛选所得,保存于-80 ℃冰箱;蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏 生工生物工程(上海)股份有限公司;氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁及其他实验所用试剂 均为国产分析纯,国药集团化学试剂有限公司;种子培养基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 5,调pH7.0;发酵培养基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,NaCl 4,MgSO4·7H2O 0.5,K2HPO4·3H2O4,调pH7.5。

GHP-9270隔水式恒温培养箱、THZ-300恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司;DGG-9203AD型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;HWT-20C恒温水浴箱 天津市恒奥科技发展有限公司;pH730台式pH精密测试仪 德国WTW;TGL-16G高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;AL204精密电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;AC2-S超净工作台 苏净集团安泰公司;

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 菌株活化:将在-80 ℃冰箱中甘油保藏的菌株置于冰上解冻复苏,接种至营养肉汤培养基活化培养18～24 h,然后接种到营养琼脂斜面培养基培养18～24 h。

液体种子培养:将活化的斜面菌种挑取一环接种于液体种子培养基中,250 mL三角瓶装种子培养基100 mL,温度37 ℃,160 r/min培养24 h。

摇瓶培养:250 mL三角瓶装50 mL发酵培养基,将种子液按3%的接种量接入发酵培养基中,温度37 ℃,180 r/min培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。

1.2.2 菌体干重测量 将摇瓶发酵培养后的菌液置于离心管中,9000 r/min离心10 min后,去掉上清液,再用无菌水洗涤2～3次并离心。菌体置于105 ℃鼓风干燥箱中烘干至恒重称其质量。

1.2.3β-内酰胺酶活力测定方法β-内酰胺酶粗酶液制备:摇瓶培养后的发酵液经高速离心机以9000 r/min离心10 min,所得上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,其过滤液即为无菌β-内酰胺酶粗酶液。

β-内酰胺酶活力测定:β-内酰胺酶活力测定参考《中华人民共和国药典》(2015年第四版);1个酶活力单位定义为:在37 ℃条件下,1 mL发酵酶液每小时分解青霉素活性单位的量,用U表示[1]。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 碳源对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,分别使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油为碳源,添加量为20 g/L,其他培养基成分不变,在37 ℃、pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。根据选定的最佳碳源,分别以不同浓度的葡萄糖(1%、2%、3%、4%、5%)配制发酵培养基,测定碳源浓度对菌株发酵产酶的影响。

1.2.4.2 氮源对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,分别使用酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、硫酸铵、脲为氮源,添加量为20 g/L,其他培养基成分不变,在37 ℃、pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。根据选定的最佳氮源,分别以不同浓度的酵母浸粉(1%、2%、3%、4%、5%)配制发酵培养基,测定氮源浓度对菌株发酵产酶的影响。

1.2.4.3 温度对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,分别调整温度为28、31、34、37、40、43 ℃,pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。

1.2.4.4 发酵初始pH对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,将发酵培养基初始pH分别调整为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,37 ℃、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。

1.2.4.5 接种量对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液分别以不同的接种量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,在37 ℃、pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。

1.2.4.6 装液量对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 通过改变相同规格的250 mL三角瓶中的装液量来改变溶氧浓度。将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,以初始发酵培养基为基础,发酵瓶装液量依次为20、30、40、50、60、70、80 mL,在37 ℃、pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。

1.2.4.7 金属离子对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,分别添加浓度为0.5 g/L的不同金属离子(Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+),其他培养基成分不变,在37 ℃、pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。根据选定的金属离子,分别以不同浓度的MgSO4·7H2O(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)配制发酵培养基,测定金属离子浓度对菌株发酵产酶的影响。

1.2.4.8 K2HPO4·3H2O对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,分别添加不同浓度的K2HPO4·3H2O(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%),其他培养基成分不变,在37 ℃、pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。

1.2.4.9 NaCl对菌株发酵产β-内酰胺酶的影响 将种子液以3%的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为50 mL/250 mL三角瓶,以初始发酵培养基为基础,分别添加不同浓度的NaCl(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),其他培养基成分不变,在37 ℃、pH7.5、180 r/min条件下培养40 h,测定发酵液酶活和菌体干重。

1.3 响应面试验设计

1.3.1 Plackett-Burman设计试验 在单因素实验的基础上,选取9个影响因素作为研究对象,以β-内酰胺酶酶活(Y)为响应值,进行试验次数N=12的Plackett-Burman(PB)设计,P-B试验设计的因素与水平见表1。每个因素分别取低(-1)和高(+1)两个水平,另设A0虚拟因素列以考察实验误差。

表1 Plackett-Burman设计变量Table 1 Process variables used in Plackett-Burman design

1.3.2 中心组合Box-Behnken响应面实验 利用Plackett-Burman设计实验筛选出三个显著性因素,即温度(A)、pH(B)、接种量(C)。采用Box-Behnken中心组合设计,以温度(A)、pH(B)、接种量(C)为自变量,以酶活力(Y)为响应值设计3因素3水平试验,中心组合试验方案中的因素及水平如表2所示,数据用Design-Expert 8.0.6软件进行分析[15-16]。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.4 数据处理

本实验用GraphPad软件进行单因素实验数据分析和制图,利用Minitab 17软件设计Plackett-Burman实验和分析实验数据。利用Design-Expert 8.0.6软件设计中心组合Box-Behnken响应面实验和分析结果。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 最佳碳源的确定 如图1所示,当葡萄糖作为唯一碳源时,菌株B03产β-内酰胺酶的酶活最高,乳糖次之,蔗糖作为碳源时,酶活最低。菌体干重大小也与各个碳源酶活的高低基本呈正比变化。随着葡萄糖含量的增加,当葡萄糖含量为2%时,产酶活力最高,进一步提高葡萄糖浓度酶活力下降。葡萄糖含量为4%时,菌体干重虽然达到最大值,但酶活不高,故选择含量为2%的葡萄糖作最适碳源,即20 g/L。

图1 不同的碳源及葡萄糖浓度对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.1 Effects of different carbon sources and glucoseconcentrations on dry cell weight and activity of β-lactamase注:不同小写字母表示同一指标不同组间差异显著(P<0.05);图2～图9同。

2.1.2 最佳氮源的确定 如图2所示,当有机氮(如蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏)作氮源时,菌株B03产酶量整体高于无机氮(如硫酸铵、脲)作氮源时的产酶量。有机氮作氮源时较无机氮作氮源时的菌株产酶量不仅存在显著性差异(P<0.05),且其菌体干重较无机氮源的菌体干重也存在显著性差异(P<0.05),说明有机氮源比无机氮源更适合菌体生长。当使用酵母浸粉作为氮源时,菌株产酶活力最高且菌体干重最大。随着酵母浸粉含量的增加,当酵母浸粉含量为2%时,产酶活力最高,进一步提高酵母浸粉浓度酶活力下降。酵母浸粉含量为3%时,菌体干重虽然达到最大值,但酶活已处下降趋势,故选择含量为2%的酵母浸粉作最适氮源,即20 g/L。

图2 不同的氮源及酵母浸粉浓度对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sourcesand yeast extract concentrations on dry cellweight and activity of β-lactamase

2.1.3 最佳温度的确定 如图3所示,随着温度的升高菌体干重及酶活都呈先增长后下降的趋势。当温度为28～37 ℃时,酶活及菌体干重呈上升的趋势;当温度为37 ℃时,酶活力最高,菌体干重也达到最大;当温度大于37 ℃时,酶活呈直线下降的趋势。因此,确定37 ℃为菌株B03产β-内酰胺酶的最佳发酵温度。

图3 温度对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.3 Effects of temperature on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.4 最佳pH的确定 如图4所示,培养基初始pH为7.0时,酶活力最高,菌体干重也达到最大,对菌株B03产β-内酰胺酶最有利。过酸和过碱都会影响菌体的增长及菌株产酶的能力。因此,确定pH7.0为菌株B03产β-内酰胺酶的最佳pH。

图4 pH对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.4 Effects of pH on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.5 最佳接种量的确定 如图5所示,当接种量为1%～3%时,菌体大量增殖,酶活力也呈直线上升,3%时酶活达到最大。随着接种量的增加,在4%时菌体干重达到最大,但由于培养基内营养物质的过度消耗影响了菌株的产酶能力,导致酶活力下降。因此,确定3%为菌株B03产β-内酰胺酶的最佳接种量。

图5 接种量对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.5 Effects of inoculum on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.6 最佳装液量的确定 如图6所示,装液量的多少主要影响菌株对溶氧的需求,进而影响菌株的生长及产酶能力。当装液量为50 mL/250 mL时,菌体干重及酶活都达到最大,装液量增加或减少,菌体干重及酶活都呈现下降的趋势。因此,确定50 mL/250 mL为菌株B03产β-内酰胺酶的最佳装液量。

图6 装液量对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.6 Effects of liquid volume on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.7 最佳金属离子的确定 如图7所示,微生物生长与生产过程中,许多金属离子都可作为辅助因子影响微生物的生长代谢,也会影响微生物的产酶能力。从图7可以看出,相比其他金属离子,镁离子对菌体生长及菌株产酶影响较大,酶活最高。因此,确定镁离子为菌株B03产β-内酰胺酶的最佳金属离子。不同浓度的MgSO4·7H2O对菌体干重及酶活的影响不显著,其中加入0.2 g/L的MgSO4·7H2O时有最大酶活。

图7 不同金属离子及MgSO4·7H2O浓度对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.7 Effects of different metal ions and MgSO4·7H2Oconcentrations on dry cell weight and activity of β-lactamase

2.1.8 最佳K2HPO4·3H2O浓度的确定 如图8所示,当K2HPO4·3H2O浓度为0.4%时,菌体干重及酶活都达到最大。随着K2HPO4·3H2O浓度的加大,菌体干重及酶活呈现阶梯型下降的趋势。因此,确定0.4%为菌株B03产β-内酰胺酶的最佳K2HPO4·3H2O浓度。

图8 不同K2HPO4·3H2O浓度对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.8 Effect of different K2HPO4·3H2O concentrationson dry cell weight and activity of β-lactamase

2.1.9 最佳NaCl浓度的确定 如图9所示,随着NaCl浓度的增加,酶活基本呈曲线下降的趋势,虽然菌体干重在NaCl浓度为0.4%时达到最大,但影响了菌株产酶能力。因此,确定0.2%为菌株B03产β-内酰胺酶的最佳NaCl浓度。

图9 不同NaCl浓度对菌体干重及β-内酰胺酶活力的影响Fig.9 Effect of different NaCl concentrationson dry cell weight and activity of β-lactamase

2.2 Plackett-Burman设计法

在单因素试验的基础上,设计Plackett-Burman(N=12)实验,对影响β-内酰胺酶发酵工艺中的9个因素的显著性进行考察。试验的设计及结果见表3。利用Minitab17软件对表3数据进行主效应分析,结果见表4。从表4中可以看出显著的三个因素为温度、pH、接种量,P值分别为0.027、0.046、0.039均小于0.05。

表3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman设计的各因素水平及主效应分析Table 4 Factors,levels and significance analysis of Plackett-Burman design

2.3 响应面设计与结果分析

2.3.1 Box-Behnken试验设计结果与回归模型的方差分析 以温度(A)、pH(B)、接种量(C)为考察因素,以酶活力(Y)为响应值,进行响应面试验设计,试验结果见表5。利用Design Expert软件对表5的数据进行多元回归拟合,得到模型的二次回归方程:

表5 Box-Behnken实验设计表及其结果Table 5 Design and results of Box-Behnken

Y=1.122×105-711.07A+8378.41B-2287.83C-803.85AB-1484.00AC+865.68BC-13423.91A2-8353.60B2-21895.05C2。

式中:Y,β-内酰胺酶的预测活力(U/mL);A、B、C,分别代表温度(℃)、pH和接种量(%)。

表6 回归模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

2.3.2 响应面曲线及等高线分析 根据Design Expert软件分析出三种显著影响因素温度、初始pH、接种量的响应面和等高线结果见图10。由各因素响应面曲线图可知,皆呈开口向下的抛物线形状,说明存在响应最大值。响应面曲线的陡缓程度和等高线的形状都可以反应因素交互作用的强弱。响应面曲线走势越陡,表明影响越显著;响应面曲线走势越平滑,表明影响越小。等高线呈椭圆形,表明两因素之间有较显著的交互作用;如果等高线呈圆形,则表明两因素之间的交互作用不显著[19-21]。结果表明:温度(A)和接种量(C)交互作用对响应面值的影响显著,温度(A)和初始pH(B)、初始pH(B)和接种量(C)交互作用对响应值的影响不显著。

图10 温度、pH、接种量交互作用对酶活力影响的响应面曲线及等高线Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between temperature,pH and inoculum on enzyme activity

2.4 验证试验

利用Design-Expert 8.0.6分析得到影响酶活力的最佳条件理论值为温度36.88 ℃,初始pH为7.25,接种量为2.96%,理论最高酶活力可高达114400 U/mL。考虑实际操作,调整最佳条件为温度37 ℃,pH为7.3,接种量3%,经过3次平行试验,测得β-内酰胺酶的平均酶活为(113278.7±1133.4) U/mL,这两个结果之间的良好相关性证实了响应模型的有效性,表明采用响应面法优化得到的最佳条件准确可靠。在优化之前的条件下:葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、NaCl 4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 4 g/L、发酵温度37 ℃、pH为7.5、接种量3%、装液量50 mL/250 mL,该菌株产β-内酰胺酶的酶活力为88792.7 U/mL,优化之后酶活力为优化之前酶活力的1.28倍,氮源的改变显著地提高了酶活,说明酵母浸粉更有利于该菌株产酶,其他培养基成分及发酵条件的改变也有效地提升了该菌株产酶能力。

3 结论

本研究在单因素实验的基础上,利用Plackett-Burman设计筛选出温度、pH、接种量三个显著因素,再用Box-Behnken中心组合设计试验确定最优产酶发酵条件。结果表明,最佳发酵培养基成分为葡萄糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、K2HPO4·3H2O 4 g/L,最佳产酶发酵条件为发酵温度37 ℃、pH为7.3、接种量3%、装液量50 mL/250 mL。在此优化条件下,该菌株产β-内酰胺酶的酶活力为113278.7 U/mL,为优化之前酶活力(88792.7 U/mL)的1.28 倍。本研究通过响应面法优化产β-内酰胺酶细菌的发酵条件,显著提高了产酶水平,为工业上生产β-内酰胺酶及其应用提供参考依据,为今后建立工程菌稳定的发酵工艺和规模化生产奠定了基础。