产亚硝酸还原酶基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21的培养基优化

彭 鑫,黄燕燕,赵 珊,孙丽娜,陈思敏,肖弘毅,刘冬梅

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

亚硝酸盐(Nitrite,NIT)主要存在于蔬菜[1]、加工肉制品[2-3]和生活饮用水中。高亚硝酸盐摄入量易导致高铁血红蛋白症,增加癌症风险[4]。目前,降低亚硝酸盐的方法有物理法、化学法、生物法,其中生物法因其高效、绿色而成为研究热点。

大多数反硝化细菌中亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase,NiR)表达量较低,而且经天然产物纯化得到NiR的工序繁杂,不可避免地出现蛋白质损失和回收率低的问题。目前大多数研究者都无法直接从破碎天然菌体后的粗酶液中提取大量的天然NiR。Ichiki 等[5]从含有6710 mg总蛋白质的Haloarculamarismortui粗酶液中仅纯化得到1.43 mg的NiR。Inatomi等[6]从含有1060 mg总蛋白质的Haloferaxdenitrificans粗酶液中仅纯化得到0.08 mg NiR。

本课题组发现蜡样芽胞杆菌LJ01[7]、植物乳杆菌DMDL 9010[8]及鼠李糖乳杆菌LCR 6013[9]能够分泌NiR,降解培养基中高浓度的NaNO2,但是其NiR表达量低。利用大肠杆菌作为外源基因的表达系统,所需投入的成本较低,但目前难以克服的问题是目的蛋白的表达往往是以难溶性的包涵体形式存在于裂解液的沉淀中[10],因此对基因工程菌的发酵工艺进行优化是十分必要的,以便在提高菌体生物量的同时还可以获得浓度较高的目的基因体外表达产物[11]。韩倩等[12]对Bacillussp. C产NiR的发酵工艺进行优化后,发现优化后目标蛋白NiR的酶活力较优化前提高了67.89%。梅旭旭等[13]优化基因工程菌表达海栖热袍菌磷酸戊糖变位酶的发酵条件,以裂解液上清中的重组蛋白在SDS-PAGE上对应条带的积分光密度来分析其可溶性表达水平,优化后磷酸戊糖变位酶表达量得到大幅度的提高。魏娜等[14]对基因改造运动发酵单胞菌的发酵工艺条件进行优化,确定最佳条件为温度28 ℃、葡萄糖浓度为24%(w/V)、pH7.4,此时重组工程菌的乙醇产量比原始菌株乙醇产量提高16.4%。

为了降低投入的成本和提高目的蛋白的产量,不少学者选择基因工程菌株作为研究对象,本文在前期研究中从豆瓣酱中筛选出一株具有强降解NIT能力的蜡样芽孢杆菌BacilluscereusLJ01,获得了B.cereusLJ01中编码NiR(nir)的全长基因序列。将B.cereusLJ01中nir基因克隆至相应的表达载体上,构建了重组菌pET-28a(+)-nir-BL21,为提高基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21的产亚硝酸盐还原酶(NiR)水平,从培养基成分出发,优化了异源表达NiR的培养基条件,为食品来源的蜡样芽孢杆菌及其NiR用于食品中NIT的控制提供理论基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜡样芽孢杆菌BacilluscereusLJ01 本课题组从豆瓣酱中筛选得到,已于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号CGMCC NO.9360;原核载体质粒pET-28a(+)、克隆宿主E.coliDH5α、表达宿主E.coliBL21(DE3) 由本实验室保存于-80 ℃冰箱中;LB培养基(生化试剂)、技术琼脂粉、亚硝酸钠、葡萄糖、甘油、酵母浸粉、大豆蛋白肽、细菌学蛋白胨、无水氯化钙、磷酸二氢钾、结晶硫酸镁、氢氧化钠、氯化镁等 广州卯林试剂有限公司。

Cyto FLEX流式细胞仪 贝克曼库尔特公司;SW-CJ-2F洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;Scientz-IID型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;5415R、5810R型离心机 德国Eppendorf;LRH-70型生化培养箱 上海一恒科技;QYC-200型恒温摇床 上海福玛实验设备有限公司;YXQ-LS100SII型立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21的构建 以B.cereusLJ01全基因组DNA为模板进行NiR的PCR扩增(上游引物:5′-CGGCATATGCCAGCT AGCATGAGTTATGAAAAAGTATG-3′,下游引物:5′-CGGCTCGAGTGGCTCGAGCTAAGACGCTATTACTTC-3′,下划线为保护性碱基,分别从其中引入NdeI和XhoI的酶切位点)。将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测后,进行纯化和回收。将纯化回收的PCR扩增产物和质粒pET-28a(+)进行NdeI和XhoI双酶切,16 ℃连接3 h以上[15-16]。将连接产物转化至E.coliDH5α,单菌落PCR验证成功后送至广州艾基生物技术有限公司进行测序。将测序成功的质粒pET-28a(+)-nir转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,分别涂布在含有25 μg/mL Kan的固体LB培养基平板上进行筛选。

1.2.2 菌量的测定 向LB液体培养基中加入浓度为25 μg/mL卡那霉素溶液,按接种量10%(V/V)接种重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21,在37 ℃、180 r/min下培养12 h后,用未接种的无菌液体LB培养基稀释至OD600小于0.1后,用流式细胞仪测定稀释液中活菌数浓度(CFU/μL),并计算原液中的活菌数浓度(CFU/mL)。空白组使用无菌的LB培养基进行校准,控制流式细胞仪对空白组的颗粒数进行记录范围在“0～10个/s”。

1.2.3 单因素实验 以液体LB培养基为基础培养基,添加不同浓度不同种类的碳源、氮源、无机盐进行单因素实验。

1.2.3.1 碳源的选择 分别向基础LB培养基中添加浓度为0、2、4、6、8、10、12、14、16 g·L-1的葡萄糖或添加浓度分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5 g·L-1的甘油,加入25 μg/mL卡那霉素溶液,接种3%(V/V)2次活化后的重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21,于37 ℃、180 r/min下振荡培养12 h后,测定重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21活菌数。

1.2.3.2 氮源的选择 分别向基础LB培养基中添加浓度为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g·L-1的酵母浸粉,或添加浓度分别为0、5、10、15、20、25、30 g·L-1的细菌学蛋白胨,或添加浓度分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g·L-1的大豆蛋白肽,加入25 μg/mL卡那霉素溶液,接种3%(V/V)2次活化后的重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21,于37 ℃、180 r/min下振荡培养12 h后,测定重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21活菌数。

1.2.3.3 无机盐的确定 分别向基础LB培养基中添加浓度为0、1、2、3、4、5、6 g·L-1的磷酸二氢钾,或添加浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 g·L-1的结晶硫酸镁,或添加浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g·L-1的氯化钙,加入25 μg/mL卡那霉素溶液,接种3%(V/V)2次活化后的重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21,于37 ℃、180 r/min下振荡培养12 h后,测定重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21活菌数。

1.2.4 Plackett-Burman试验 在单因素实验基础上,运用Minitab 17软件通过设计Plackett-Burman试验设计法,对上述影响因素进行筛选。每个因素分别取低(-1)和高(+1)两个水平(表1),共12个试验组合。每个处理重复3次,取平均值即为试验结果。

表1 Plackett-Burman试验设计因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.5 Box-Behnken试验 在Plackett-Burman试验基础上,得出葡萄糖、甘油、细菌学蛋白胨这三个因素对重组菌的生长影响最显著。利用响应面分析法对重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21培养基配方进行优化,利用Design-Expert 8.0.6软件,用Box-Behnken模型(试验设计见表2)建立三因素三水平数学模型[13],以活菌数为指标优化培养基成分。

表2 Box-Behnken试验设计Table 2 Design of Box-Behnken experiment

1.3 数据处理

所有实验均重复3次。Plackett-Burman试验采用Minitab 17软件进行设计,响应面试验设计采用Design-Expert 8.0.6软件设计。利用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,数据间的分析采用单因素方差分析和Duncan多重比较法,显著性水平均设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 NiR的编码基因扩增与测序结果

将B.cereusLJ01中nir序列上传至NCBI中,获得登录号为MG839504,用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,从图1可以看出PCR扩增产物条带单一,大小约1600 bp,由此可判断B.cereusLJ01中nir扩增成功。

图1 NiR编码基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Gel electrophoresis of PCR-amplifiednir from B. cereus LJ01注:M:Marker;1、2、3:表示PCR扩增产物的3个平行。

2.2 培养基成分的单因素优化

2.2.1 碳源对重组菌生长的影响 如图2所示,当在LB培养基中添加不同量的葡萄糖和甘油时,呈现出菌量先增后减的趋势。图2A可以看出,随着葡萄糖的添加量由2 g·L-1提高到4 g·L-1,重组菌pET28a-nir-BL21活菌数达到最大值(2.85±0.0017)×108CFU·mL-1,继续添加葡萄糖含量至6 g·L-1,重组菌pET-28a(+)-nir-BL21活菌数下降至(2.05±0.0028)×108CFU·mL-1,随后变化趋于平稳。葡萄糖含量较低时,重组菌pET-28a(+)-nir-BL21活菌数随着葡萄糖含量的提高而增多;当达到一定阶段时,又随着葡萄糖含量的提高而下降。葡萄糖的含量较高时可以抑制细菌的生长。这种现象可能是由于重组菌pET28a-nir-BL21具有反馈抑制体系,不同菌株存在不同单糖转运与转化系统有关[12]。图2B可以看出,在甘油浓度为2.5 g·L-1时,菌量达到最大值2.22×108CFU·mL-1,黏稠状的甘油可能对B.cereusLJ01生长具有一定的影响。两种碳源对重组菌的促进作用差异不大,葡萄糖略好于甘油。故选用两种碳源进行接下来的试验,选取葡萄糖浓度为2～6 g·L-1,甘油浓度为0～5 g·L-1。

图2 不同碳源浓度对重组菌pET-28a(+)-nir-BL21生长的影响Fig.2 Effect of different carbon sources concentrations on thegrowth of the recombinant bacteria pET-28a(+)-nir-BL21注:A:葡糖糖;B:甘油;不同小写字母表示同一组数据之间具有显著性差异;图3～图4同。

2.2.2 氮源对重组菌生长的影响 由图3A可知,重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21的活菌数随着酵母浸粉加入量浓度的增大而增大,当酵母浸粉浓度达到12.5 g·L-1时,重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21的活菌数达到最大值(4.15±0.028)×108CFU·mL-1。由图3B可知,重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21的活菌数呈现出先增长后减少的趋势,说明过多的氮源会对产生底物抑制作用,不利于其生长。在细菌学蛋白胨浓度达到10 g·L-1时,菌量达到最大值(3.83±0.068)×108CFU·mL-1。由图3C可知,一定浓度的大豆蛋白肽对重组菌的生长有着促进作用,当大豆多肽浓度达到2.5 g·L-1时,菌量有最大值(3.74±0.011)×108CFU·mL-1。这是因为大豆多肽是大豆蛋白经过蛋白酶水解制得的短肽类混合物,重组菌pET-28a(+)-nir-BL21可以直接利用小分子或氨基酸进行生长代谢,促进生长繁殖[17]。三种氮源对重组菌的生长促进生长作用显著,故选取三种浓度分别为10～15 g·L-1的酵母浸粉,5～15 g·L-1的细菌学蛋白胨,0～5 g·L-1的大豆蛋白肽进行接下来实验。

图3 不同氮源浓度对重组菌pET-28a(+)-nir-BL21生长的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources concentrations on thegrowth of the recombinant bacteria pET-28a(+)-nir-BL21注:A:酵母浸粉;B:细菌学蛋白胨;C:大豆多肽。

2.2.3 无机盐对重组菌生长的影响 无机盐主要为生物体提供各种重要的生命元素,具有维持细胞稳定性、内环境pH稳定、调节细胞渗透压和作为酶的激活剂等[12]。图4A可以看出重组菌pET-28a(+)-nir-BL21的活菌数随着KH2PO4浓度的增大而增大,当KH2PO4浓度为4～5 g·L-1达到最大值。这与张媛媛等[18]的结论一致。磷酸盐中的磷是构成蛋白质和核酸不可缺少的元素,磷浓度对菌体的生长有很大影响。重组菌菌落总数随着结晶硫酸镁和CaCl2浓度的增加有先增加后减少的趋势,当结晶硫酸镁浓度为0.2 g·L-1,CaCl2浓度为0.2 g·L-1达到最高的菌落总数。这说明过量的Ca2+、Mg2+对重组菌株pET-28a(+)-nir-BL21的生长有抑制作用。整体来说,无机盐对重组菌的促进作用较碳源和氮源来说并不显著,故只选取其中影响程度较大的浓度为3～6 g·L-1KH2PO4进行接下来的实验。

图4 不同无机盐浓度对重组菌pET-28a(+)-nir-BL21生长的影响Fig.4 Effect of different inorganic salts concentrations on thegrowth of the recombinant bacteria pET-28a(+)-nir-BL21注:A:KH2PO4;B:结晶硫酸镁;C:CaCl2。

2.3 Plackett-Burman试验结果

在前期单因素的基础上,选取其中六个对重组菌生长具有显著促进作用的因素,运用Minitab 17软件设计Plackett-Burman试验,以发酵液中菌落总数为响应目标。实验设计及结果见表3,各因子效应及显著性见表4。

表3 Plackett-Burman设计及结果Table 3 Design and results of Plackett-Burma experiments

表4 Plackett-Burman试验因子显著性分析Table 4 Significance analysis of terms in Plackett-Burma experiment

由表4可知,在促进重组菌pET28a-nir-BL21生长方面,葡萄糖、甘油、细菌学蛋白胨的贡献度较高,分别为25.90%、11.66%和11.09%,其他几个因素的贡献值均不高于3%。结果表明,在这六种促进因子中,加入葡萄糖、甘油、细菌学蛋白胨,对重组菌pET28a-nir-BL21生长起促进作用,且葡萄糖、甘油、细菌学蛋白胨的贡献值远远高于其他的因素,因此选择葡萄糖、甘油、细菌学蛋白胨作为研究对象,进行Box-Behnken优化实验。

表4 对重组菌生长的响应面分析试验设计及结果Table 4 Designs and results of response surface experimentson the growth of the recombinant bacteria

2.4 Box-Behnken试验设计及响应面分析

2.5 响应面因子交互作用结果

将葡萄糖、甘油、细菌学蛋白胨添加量3个参数分别固定,通过Design Expert 8.0.6软件绘制该模型的各影响因子两两交互作用的响应曲面及其等高线图,如图5～图7所示。两变量交互作用的大小可通过等高线的线间疏密程度和曲面形状来判断。曲面呈椭圆形、线间距密,则说明两因子之间的交互作用对响应值影响显著,反之,则不显著。而响应曲面倾斜度大也说明两因子之间的交互作用大。根据回归方程的一次项系数及表5分析,各因素对重组菌的影响程度为细菌学蛋白胨>葡萄糖>甘油。根据回归方程的二次项系数以及图5～图7所示,AC、AB交互项对响应值的影响较BC大,但三种因素间的两两交互作用对响应值的影响均不显著,这与表5分析一致[20-21]。

表5 回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

图5 葡萄糖和甘油对重组菌pET28a-nir-BL21 活菌数的影响Fig.5 Effect of glucose and glycerin on the active bacteria number of the recombinant bacteria pET28a-nir-BL21

图6 葡萄糖和细菌学蛋白胨对重组菌pET28a-nir-BL21活菌数的影响Fig.6 Effect of glucose and bacterial protein on the active bacteria number of the recombinant bacteria pET28a-nir-BL21

图7 甘油和细菌学蛋白胨对重组菌pET28a-nir-BL21活菌数的影响Fig.7 Effect of glycerin and bacterial protein on the active bacteria number of the recombinant bacteria pET28a-nir-BL21

2.6 验证试验

根据响应面建立的数学模型,对回归方程求一阶偏导,得到对于重组菌菌量达到最大值的最佳培养条件为:以液体LB培养基为基础,添加葡萄糖3.72 g·L-1,甘油2.63 g·L-1,细菌学蛋白胨8.70 g·L-1,在此条件下的预测的菌量能达到3.14×108CFU·mL-1。为进一步加以验证预测结果,采用得到的培养基优化最佳配方进行三次平行实验,计算得到重组菌的菌量为3.02×108CFU·mL-1,与预测值相差不大,拟合率达96.17%,说明通过Box-Behnken试验设计建立的数学模型是准确可靠的。

3 结论

在基础LB培养基成分上,通过单因素实验、Plackett-Burman试验和Box-Behnken Design(BBD)设计试验,利用Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析,从培养基成分角度对重组菌pET-28a(+)-nir-BL21活菌数进行初步优化,取得了良好的效果,获得了最佳培养基成分配方为:以LB 培养基为基础培养基,添加葡萄糖 3.72 g·L-1、甘油2.63 g·L-1和细菌学蛋白胨 8.70 g·L-1。在此条件下,获得的重组菌的活菌数为 3.02×108CFU·mL-1,此结果为工业化生产亚硝酸盐还原酶提供了理论依据。