酶催化木薯淀粉表面松香酸酯化改性及表征

杨 慧,姜 赛,樊艳叶,林玉娇,林日辉

(广西民族大学化学化工学院,广西多糖材料与改性重点实验室,广西高校化学与生物转化过程新技术重点实验室,广西南宁 530006)

酯化淀粉是一类新型的改性淀粉,由淀粉葡萄糖单元上的游离羟基被酯化剂取代得到[1]。目前酯化淀粉的制备方法有化学法与酶催化法[2]。多数淀粉酯的制备采用化学合成法[3],而相对于化学方法,酶催化法具有对环境友好、减少有毒溶剂使用等优点[4],因此酶催化法合成淀粉酯是酯化淀粉发展的一个方向。通常酶催化合成酯化淀粉利用固定化酶在均相条件下进行[5],但其中固定化酶昂贵,淀粉只能少量溶解于二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)及吡啶等强极性试剂[6],且后处理繁琐,同时强极性溶剂会使酶活力降低[7],反应效率较低。

松香淀粉酯(RAS)是一类由大分子松香酸基团与大分子淀粉通过酯基团结合的新型酯化淀粉。最早由唐世华等[8]利用松香酰氯与淀粉在吡啶的催化下合成了RAS,Lin等[9]首次利用固定化脂肪酶催化碱预处理木薯淀粉与松香酸合成松香淀粉酯。但RAS的高成本、低效率使RAS的应用受到限制。

为了改善RAS的合成条件,本文以中极性溶剂氯仿为溶剂,利用廉价的液体脂肪酶作为催化剂,在两相体系中对木薯淀粉进行表面修饰合成RAS。并对RAS的结构及理化性质进行分析,以实现在不破坏淀粉原有形貌的情况下对其表面的酯化修饰。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木薯淀粉(食品级) 广西岑溪市三角淀粉有限责任公司;松香(二级) 广西武鸣县朝燕林松香厂;脂肪酶(100000 U/mL) 绵阳禾本生物工程有限公司;氯仿、盐酸、氢氧化钠等 均为国产AR级。

TG1650R-WS型台式高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;WGLL-65BE型电热鼓风干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司;FE28型pH计 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;KJMR-IV型血液混匀器 江苏天翎仪器有限公司;RT10型磁力加热搅拌器 德国IKA公司;SUPRA 55 Sapphire场发射扫描电子显微镜 德国ZEISS公司;STA 449C同步热分析仪 德国NETZSCH仪器制造有限公司;MiniFlex600型X射线衍射仪 日本理学公司;OCA20型接触角测量仪 德国Dataphysics公司;Magna 550型红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 木薯淀粉的表面酯化 参考巫佳等[10]的报道,准确称量3 g的木薯淀粉和12 g松香置于150 mL锥形瓶中,加入50 mL氯仿,将锥形瓶置于55 ℃ 180 r/min摇床中,待松香溶解完全(约15 min),加入200 μL蒸馏水和200 μL脂肪酶,反应一定时间后(反应时间分别为1、2、6、7、10、11、18 h,制备RAS的DS分别为0.0083、0.0099、0.0265、0.0287、0.0502、0.0539、0.0601),5000 r/min常温离心5 min,收集沉淀,用无水乙醇清洗四次,每次15 min,布氏漏斗抽滤,收集滤饼,60 ℃干燥过夜至恒重制得松香淀粉酯(RAS)。

1.2.2 酯化取代度检测 参考文献[9]并根据实验条件适当调整,准确称取2 g松香淀粉酯样品置于250 mL三角瓶中,加入50 mL 0.1 mol/L的NaOH标准溶液,55 ℃水浴振荡3 h,冷却至室温,滴加4滴10 g/L酚酞指示剂使溶液呈红色,然后用0.05 mol/L的HCl标准溶液滴定至无色,记录消耗盐酸体积,根据公式(1)、公式(2)计算松香淀粉酯的取代度(DS)。

式(1)

式(2)

式中:V1:滴定空白消耗的盐酸标准溶液的体积(L);V2:滴定样品消耗的HCl标准溶液的体积(L);C:HCl标准溶液的浓度(mol/L);m:样品质量(g);285:松香基团的平均相对分子质量;W:酯化产物上松香基团的质量分数;DS:淀粉分子中每个葡萄糖单元上的羟基平均被取代的数目;162:淀粉葡萄糖单元的相对分子质量。

1.2.3 红外光谱(FT-IR)分析 将一定量RAS(DS分别为0.0265、0.0502)和原木薯淀粉粉末分别与KBr研磨均匀,取适量的混合粉末利用压片机制成透明的薄片,用Magna 550型傅立叶变换红外光谱仪测定试样的红外谱图,分辨率为4 cm-1,扫描范围400～4000 cm-1[11]。

1.2.4 扫描电镜(SEM)分析 将待测一定量RAS(DS分别为0.0265、0.0502)和原木薯淀粉粉末均匀的洒在导电胶上,用洗耳球轻轻吹去浮粉,在真空状态下喷铂,制成电镜观察样品,利用场发射SEM进行观察拍照。

1.2.5 X-射线衍射(XRD)分析 用MiniFlex 600型X射线衍射仪(理学公司)对RAS(DS=0.0502)及原木薯淀粉试样进行XRD表征,CuKa射线,Ni滤波,管电流20 mA,管电压40 kV,扫描速率4 °/min,扫描范围10 °～60 °[12]。

1.2.6 热重差(TGA)分析 分别精确称取RAS(DS分别为0.0287、0.0539、0.0601)与原木薯淀粉样品3～10 mg,通入N2,升温测试,升温速率10 ℃/min,温度范围30～600 ℃,通N2速率30 mL/min[13]。

1.2.7 接触角测定分析 参考文献[14-15]中的操作,测量方式为液滴法测量静态接触角,将适量原木薯淀粉及RAS(DS分别为0.0083、0.0099、0.0265、0.0502)于75 ℃溶解在DMSO中,均匀滴加在盖薄片上,于80 ℃真空干燥箱干燥成膜,利用自动进样装置滴加2 μL蒸馏水,待水滴稳定后,从样品的十个不同位置测量得到平均接触角并拍照。

1.2.8 乳化稳定性分析 参考文献[16]并作出适当调整,分别将0.5 g原木薯淀粉及RAS(DS分别为0.0083、0.0099、0.0265、0.0502)精确称量置50 mL烧杯中,加入20 mL豆油,超声1 min,加入25 mL蒸馏水,超声波细胞粉碎机超声20 min,得到油-淀粉乳状液,将乳状液分装置10 mL离心管中,3000 r/min离心10 min,准确测量乳化层高度和液面总高度,按式(3)计算乳化能力。放置48 h后,3000 r/min离心10 min,再次测量乳化层高度和液体总高度,按式(4)计算乳化稳定性。

式(3)

式(4)

1.3 数据处理

每组实验设立三个平行。采用Mcrosoft office excel 2010进行数据收集与整理,用Origin 9.0进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 FT-IR分析

从图1中的样品A、B、C发现,对比原木薯淀粉,RAS在1728 cm-1附近产生一个新的特征峰,为酯羰基的特征吸收峰,且随着DS的增大,羰基的特征峰逐渐增强。表明在脂肪酶催化下松香酸的羧基和木薯淀粉的羟基发生了酯化反应,成功合成了RAS[17],合成反应方程式如图2所示。这与唐世华等[8]在吡啶催化松香酰氯与淀粉合成松香淀粉酯的报道相似。

图1 FT-IR分析Fig.1 FTIR spectra analysis注:A:原木薯淀粉;B:RAS(DS=0.0265);C:RAS(DS=0.0502)。

图2 RAS的酶促酯化反应方程式Fig.2 Enzymatic esterification reaction equation of RAS

2.2 SEM分析

原木薯淀粉和RAS的电镜图如图3所示,对比图3发现木薯淀粉经松香酸酯化修饰其基本形貌未发生变化仍保持圆形或椭圆形,但原淀粉表面光滑,酯化反应后生成了球团似的斑点(酯化斑点)[18],表面较为粗糙,说明松香酸的酯化取代反生仅发生在木薯淀粉表面。但通过图3B与图3C可以发现,不同DS的RAS的表面的酯化斑点并无明显区别。

图3 电镜图(5000×)Fig.3 SEM images(5000×)注:A:原木薯淀粉;B:RAS(DS=0.0265);C:RAS(DS=0.0502)。

2.3 XRD分析

原木薯淀粉和RAS的X射线衍射图如图4所示,RAS与原木薯淀粉在15.12°、17.06°、18.01°和23.03°附近都有4个较强的衍射峰,说明木薯淀粉经酯化取代后晶型未发生转变,仍保持A晶型[19]。但对比原淀粉,RAS在15.12°、17.06°处的峰强明显降低,说明经酯化合成后淀粉结晶区结构被部分破坏,结晶度下降。

图4 X射线衍射图Fig.4 XRD pattern 注:A:原木薯淀粉;B:RAS(DS=0.0502)。

2.4 TGA分析

原木薯淀粉和RAS的TGA的分析图如图5所示,在测试温度30～600 ℃范围内,原木薯淀粉和RAS有两个热失重过程,首先第一个热失重出现在100 ℃附近,为分子内结晶水的蒸发过程。第二个热分解过程出现在250～350 ℃范围内,对比原木薯淀粉,RAS分解的起始温度和最大温度均提前,松香酸的酯化取代使淀粉分子间的氢键被破坏,分子变的疏松,一定程度上改变了淀粉的结晶结构。这与Lin等[19]的报道结果相吻合。即经松香酸改性后的淀粉热稳定性下降,且取代度越高最大热分解温度越低。

图5 的TG和DTG分析Fig.5 TG and DTG analysis注:a:原木薯淀粉;b:RAS(DS=0.0287);c:RAS(DS=0.0539);d:RAS(DS=0.0601)。

2.5 接触角测定分析

淀粉分子上分布着大量羟基,具有较强的亲水性;松香酸为三元菲环类化合物[20],类似于石油基脂环族和芳族化合物,它赋予松香疏水性、刚性及化学稳定性。在淀粉的羟基上接上非极性的松香酸基团,可以一定程度改善淀粉的疏水性能。原木薯淀粉和RAS接触角检测如表1所示,原木薯淀粉的接触角为48.9°,经酯化修饰后,RAS的接触角明显增大,且随着RAS的DS的提高,其接触角也随之升高,当RAS的DS为0.0502时,其接触角比原淀粉提高了63.39%。Thiebaud等[21]在脂肪酸淀粉酯的疏水性研究中有类似报道。说明本文成功对淀粉进行了疏水改性。

表1 接触角分析Table 1 Contact angle analysis

2.6 乳化稳定性分析

淀粉的疏水改性除了疏水性的改善还表现为亲脂性能的提高。由表2可知,原淀粉的乳化能力、乳化稳定性分别为1.53%、1.50%,淀粉经松香酸修饰后,其乳化能力及乳化稳定性最大可达到均明显提高,且随着DS的升高,RAS乳化能力及乳化稳定性也随之提高[18],最大可分别达到31.91%、23.08%。这与接触角的实验结果相吻合。

表2 乳化性能及其稳定性分析Table 2 Emulsification performance and stability analysis

3 结论

与原木薯淀粉相比,RAS的FT-IR光谱图中在1728 cm-1附近出现羰基的特征吸收峰,RAS的颗粒形貌并未发生改变,但其表面产生了酯化斑点,即成功在两相体系中将松香酸基团接在木薯淀粉表面;经松香酸酯化修饰后,RAS仍保持A晶型,但结晶度降低;随着RAS的DS的提高,其最大热裂解温度降低,疏水性能、乳化能力及乳化稳定性提高。各表征结果成功说明了木薯淀粉经酯化改性后的变化或随DS提高表现出的发展趋势。同时也为淀粉在疏水材料的应用方面提供研究方向。但RAS的取代度还很低,通过将木薯淀粉纳米化提高淀粉比表面积是接下来进一步提高DS研究的方向。