普通冻藏温度下金枪鱼生鱼片中特定腐败菌筛选及货架期预测模型研究

马锦涛，霍健聪

（浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022）

金枪鱼(tuna)是一种大型远洋性重要商品食用鱼，金枪鱼肉色鲜红，生活海域水体高度净洁，使其成为一类肉味鲜美，营养丰富，食用安全性高的高品质海水鱼，被国际营养学会列为世界三大营养鱼类之一[1-3]。近年来，随着我国渔业不断向远海进发，金枪鱼已成为国内远洋渔业的重要捕捞对象，浙江舟山建立了国内规模最大的“中国南方金枪鱼交易中心”，并形成了以舟山为中心，辐射长三角地区的金枪鱼捕捞、运输、交易和加工中心，金枪鱼鱼片等产品已成为浙江省特色农产品之一。

目前，生鱼片是金枪鱼的主要加工产品，金枪鱼鱼片品质的有效保持依赖于覆盖加工、运输和销售全程的超低温冷链。由于技术和经济等原因，国内金枪鱼加工产业尚不能实现加工链中超低温冷链的全程覆盖，部分企业的金枪鱼鱼片产品在运输、销售过程中由于部分冷链环节温度升高而发生鱼片品质变差，甚至发生腐败变质，不仅引起重大经济损失，也给食品安全带来重大隐患。本研究旨在通过对金枪鱼鱼片中主要腐败菌的分离筛选，明确引起金枪鱼鱼片发生腐败变质的主要微生物，并初步建立基于温度的金枪鱼生鱼片的货架期预测模型，以期为金枪鱼鱼片的保藏提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金枪鱼鱼片：由宁波大洋世家水产有限公司提供，原料为大眼金枪鱼Thunnus obesus 选鱼体背部赤身部位；原料装入含有经超低温冰箱预冻结的冰袋的泡沫箱后，2 h 内运至实验室，并放在超低温冰箱中，备用。

1.2 主要设备及型号

超净工作台(SW-CJ-1D，苏州净化)；微生物培养箱(HWS-150，上海森信实验仪器有限公司)；压力蒸汽灭菌器(LDZM-40L-III，上海申安医疗器械厂)；生物显微镜(奥林巴斯BX-51，日本奥林巴斯)；超纯水机(BDP-GS，南京权坤生物科技有限公司)；色差仪(CS-810，杭州彩谱科技有限公司)；其余均为试验室常用设备，所用的培养基及化学试剂均购自国药集团上海化学试剂有限公司，化学试剂为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 挥发性盐基氮(TVBN)的确定

样品从超低温冰箱中取出后，切成4 cm×4 cm×0.5 cm 规格的鱼片，放在PE 保鲜膜覆盖的泡沫盒中，置于0、-10 和-18 ℃条件下贮藏，定期取出测定TVBN，TVBN 的测定参考GB/T 5099.44-2003。

1.3.2 菌落总数的确定

样品处理参照1.3.1。菌落总数的测定方法以GB/T 4789.2-2008 为标准。

1.3.3 色差测定

生鱼片色差测定采用色差仪。测定结果采用亮度L*、黄度b*、红度a*和ΔE 表示，其中L*值越大则鱼片亮度越大；a*值越大表示鱼片红色越深，a*值小则偏向绿色；b*值则指征鱼片的黄色程度，数值大表明黄色深，反之则表明蓝色深度大；ΔE 表示总色差，ΔE 越小表明鱼片色泽越好。

其中ΔL*，Δa*，Δb*表示处理组同空白之间的差，以超低温冷冻的金枪鱼生鱼片为空白。

1.3.4 生鱼片货架期的确定

食品货架期是指在推荐条件下贮藏的食品，能保持高度的食品安全以及良好的感官和理化性质等特性的时间。本研究参考上海市地方标准《生食动物性海水产品(DB31/2013)》和国家标准《鲜、冻动物性水产品卫生标准(GB 2733-2005)》，菌落总数超过105CFU·g-1或TVBN 超过30 mg·100-1·g-1时可看做货架期终点。

1.3.5 生鱼片菌相的确定[4,9]

从1.3.2 的平板上挑取单菌落进行纯化分离，而后对单菌落进行生化特征分析。

1.3.6 生鱼片货架期方程的构建[5]

首先构建生鱼片腐败微生物的生长曲线模型，具体采用修正的Gompertz 方程：

式中，t 是培养时间(h)；N(t)是培养到t 小时的菌落总数；N0和Nmax分别是初始的菌落总数和菌落总数极值(Log cfu·g-1)；μmax是最大比生长速率(h-1)；Lag 意为微生物生长的迟滞时间(h)。将各种实验条件下测得的时间(t)和对应的菌数值logN(t)和方程通过Marquardt 迭代法进行拟合，得到logN0和logNmax，而后得到μmax和Lag，最终确定实验条件下的微生物生长模型，最后利用该生长模型构建基于Gompertz 方程的货架期模型：

式中，SL(h)是该方程预测的货架期，Ns为菌落总数极值。

2 结果与分析

2.1 不同温度下金枪鱼生鱼片TVBN 的变化

图1 是金枪鱼生鱼片不同温度下TVBN 的变化。生鱼片的初始TVBN 含量仅为6 mg·100-1·g-1左右，是新鲜鱼片的标志，但随着实验时间延长，温度对生鱼片TVBN 的影响很大。从图中可以看出，尽管3 个贮藏温度下TVBN 均呈现上升趋势，但温度越高，上升幅度越大，其中0 ℃条件下的生鱼片仅过了6 d 即超过30 mg·100-1·g-1，被认为发生了腐败变质，而-10 ℃条件下的鱼片达到变质的时间为10 d，-18 ℃组的鱼片则在整个实验过程中始终未超标。

图1 鱼片贮藏过程中TVBN 的变化Fig.1 Changes of TVBN during the storage of sashimi

2.2 不同温度下对生鱼片菌落总数的影响

图2 是不同温度对金枪鱼生鱼片菌落总数的影响。从图2 可知，菌落总数的增长同温度紧密相关，温度越高，则菌落总数增长数量越多，速度越快。0 ℃条件下的生鱼片第6 d 时已经达到7 log，已经达到腐败标准，而-10 ℃鱼片组达到腐败的时间则为第10 d，-18 ℃鱼片组在第14 d 时才接近腐败标准。从菌落总数和时间的关系来看，与TVBN 的变化趋势大致相同。因此，考虑到TVBN 指标，将金枪鱼生鱼片的货架期分别确定为14 d(-18 ℃)、10 d(-10 ℃)和6 d(0 ℃)。

图2 贻贝贮藏过程中菌落总数的变化Fig.2 Changes of total numbers of colony during the storage of sashimi

2.3 不同温度对金枪鱼生鱼片色度的影响

金枪鱼鲜艳的红色不仅是金枪鱼生鱼片的重要商品价值标志，也是金枪鱼鲜度的重要指标。从表1 可以看出，不同处理组样品在达限时间时色度同空白相比差异显著，保存时间越长、贮藏温度越高，则色度越差，其中0 ℃贮藏鱼片的红度达到26.8，肉色呈现非常黯淡的深红发黑，而-18 ℃贮藏的鱼片同空白相比，除黄度外，亮度、红度都差异较小，外观差异不大。

表1 不同温度处理条件下鱼片达限时间的色度Tab.1 The chroma of sashimi at the end of storage with different temperature

2.4 金枪鱼生鱼片中主要微生物的分离及种属鉴定

表2 是从金枪鱼生鱼片(-18 ℃)中分离纯化并经生化鉴定后所得的微生物种类。从表2 中可知，分离得到的微生物共有10 个种属，包括假单胞菌属、肠杆菌属等，其中假单胞菌属数量最多(56 株)，占总菌株的58%。金枪鱼生活环境水体高度净洁，微生物种类相对简单，但捕捞运输过程中极易受到二次污染，造成金枪鱼鱼体上微生物种类繁杂；捕捞后的金枪鱼的贮藏环境通常都处于超低温环境(-60 ℃)，超低温运输过程中部分微生物死亡，菌相又发生巨大变化，幸存下来的微生物能够适应低温环境，并可继续生长繁殖并造成鱼体腐败，这种微生物称为特定腐败微生物[6]。图3是不同温度条件下生鱼片到达贮藏终点时的微生物种属结果，结果显示不同实验组达限时间的微生物菌属数量相同，且均以假单胞菌属数量最多，这一结果与南美白对虾中的微生物分布类似[7,10]。其中0 ℃组中假单胞菌属比例达到62%，且该组的鱼片也可以明显感到腐败气味，因而将假单胞菌属确定为金枪鱼生鱼片的特定腐败微生物。蓝蔚青[8]等同样以大眼金枪鱼为原料，对其冷链和断链两种保藏条件下的微生物进行了分离鉴定，从中分离出希瓦氏菌数、假单胞菌数等12 种微生物，且以热死环丝菌属、假单胞菌数和嗜冷杆菌属为优势腐败微生物。这同本研究结果不同，可能是由于样品选取部位不同导致。

图3 不同温度条件下贻贝贮藏终点时微生物菌相Fig.3 The bacteriological phase of sashimi at the end of storage with different temperature

表2 金枪鱼生鱼片中主要微生物Tab.2 Main microorganism in tuna sashimi

2.5 普通冻藏条件下金枪鱼生鱼片货架期模型的建立

2.5.1 鱼片冻藏过程中特定腐败微生物的变化

图4 是利用假单胞菌专属培养基对鱼片冻藏过程中的假单胞菌属微生物进行测定的结果。从图中可以看出，在达限时间内，各实验组中假单胞菌属微生物的对数值分别为3.88(-18 ℃)、4.46(-10 ℃)和5.82 d(0 ℃)。

图4 不同温度下贻贝中假单胞菌属数量变化Fig.4 Changes of Pseudomonas in sashimi with different temperature

2.5.2 不同温度下生鱼片中生长模型的构建

将2.5.1 的生鱼片中微生物生长的相关数据同Gompertz 方程进行拟合修订，利用Marquardt 迭代法，通过非线性回归获得不同处理条件下生鱼片中微生物的生长参数。

将表3 中的相关数据带入生长模型方程，得到不同处理条件下假单胞菌属微生物的生长模型。

表3 生鱼片在不同温度下假单胞菌属生长参数Tab.3 Growth parameters of Pseudomonas in sashimi with different temperature

-18 ℃条件

-10 ℃条件

0 ℃条件

2.5.3 不同处理条件下鱼片冷藏货架期模型

表4 是不同处理条件下鱼片到达货架期终点时的Ns和Nmax值。

表4 不同处理条件下鱼片组的Ns 和Nmax 值Tab.4 Ns and Nmax of different treatment of sashimi

构建-18～0 ℃金枪鱼生鱼片冻藏货架期时将Ns和Nmax取平均值后带入方程，得到货架期方程如下：

货架期方程建立后，实验人员又对其准确性进行了验证，将金枪鱼生鱼片置于-5 ℃和-12 ℃温度下进行冻藏，通过检验初始菌落数(2.04×103CFU·g-1和2.0×103CFU·g-1)，带入货架期方程后得到其预测货架期为7.24 d 和11.68 d。试验期间每日检测样品菌落总数，结果为当时间分别为170 h 和275 h 时菌落总数超标，因而，该方程对于预测金枪鱼生鱼片的非超低温冷冻温度范围内的货架期具有较为准确的预测效果。

3 结论

金枪鱼品质好，营养价值高，但保藏条件极为苛刻，需要全程的超低温冷链。在当前国内超低温冷链尚不能全程覆盖的情况下，温度波动会引发腐败微生物生长，引起鱼片色泽变差、营养价值和商品价值降低、产生食品安全隐患。本研究以此为出发点，筛选和确定了大眼金枪鱼赤身部位的特定腐败微生物，并对鱼片进行了低温冷冻范围的货架期预测进行了研究，结果表明假单胞菌属微生物是金枪鱼生鱼片的主要腐败微生物，构建的货架期预测模型能够准确预测-18～0 ℃范围内鱼片货架期。