MALDI-TOF-MS技术在块菌、美味牛肝菌物种快速甄别中的运用*

陈丽萍，闫占鹏，赖梦书，陈 芸，李 芳，吕廷保，范效英，刘 燕，丁元明**

（1.昆明海关技术中心，云南 昆明 650200；2.安图实验仪器（郑州）有限公司，河南 郑州 450001；3.河口海关综合技术服务中心，云南 河口 661300）

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一种新兴的高通量生物质谱技术，具有高灵敏度、高通量、快速、准确、易于实现自动化等优点，已成功应用于蛋白质、DNA/RNA、多糖等生物大分子的检测，尤其是给临床微生物检验领域及菌株耐药性评定等领域带来新的思路[1-4]。目前已将MALDI-TOF-MS技术应用于大型食用菌甄别鉴定中，并确定液氮甲酸法为合适的前处理方法，得到云南香格里拉地区和四川稻城地区的松茸蛋白指纹图谱[5]。至今，未见运用该技术进行云南出口高价值特色野生食用菌块菌（Tuber indicum Cooke & Massee）、美味牛肝菌（Boletus bainiugan Dentinger）物种鉴定检测的文献报道。

云南优越的地理、气候条件，孕育了丰富多样的野生食用菌种类。全球已报道2 500余种野生食用菌，我国已知约1 000种，云南野生食用菌记载近900种，约占世界食用菌物种36%，全国的90%，因此，云南是当之无愧的野生菌王国[6]。从产量和国内外市场份额看，云南野生食用菌的数量及产量均独占鳌头，风味品质首屈一指，每年均有大量著名且订购需求量巨大的野生食用菌类，如块菌、美味牛肝菌等云南特色高价值野生食用菌从云南出口至欧美等地区[6-7]。野生食用菌出口是云南省重要的经济贸易支柱产业，而随着云南特色高价值野生食用菌知名度增加，国内外营销渠道扩宽，已有一些国家或地区要求出具野生食用菌物种甄别的官方证明。

美味牛肝菌、块菌都是典型的共生菌，与树木以及土壤中的微生物存在生态共生关系，人们无法将其从复杂的森林生态中剥离并单独进行栽培，人工促繁技术无法跟上目前的生产模式和商业需求[8-9]。因此，对野生食用菌无序、过度的开发现状，将造成资源的严重破坏，甚至物种濒临灭绝[7,10]。物以稀为贵，在高额经济利益的驱使下，野生食用菌贸易中易出现不良商贩掺假、混杂、品种替代的情况。

块菌、美味牛肝菌蛋白质含量丰富，药用价值高，长期食用能增强机体免疫能力，具有抗肿瘤、抗突变、降血脂[11-13]等功效，深受国内外消费者的喜爱。且新鲜程度越高，其贸易价值越高，为了促进野生食用菌产业贸易的良性发展，需要建立一种快速、高通量的物种甄别方法。通过运用MALDITOF-MS技术，首次对块菌和美味牛肝菌2种云南出口特色高价值野生食用菌进行种类鉴别对比分析，为野生食用菌产业的贸易发展提供有利条件。

1 试验方法

1.1 试验仪器

Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统，安图实验仪器（郑州）有限公司；sartorius 1-14离心机sigma公司；KQ-100KDE超声波清洗器，昆山超声仪器公司；微量移液器，Thermo公司。

1.2 试验试剂

考马斯亮蓝G-250试剂，北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；磷酸，上海麦克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）标准品、液氮，河南源正科技发展有限公司；甲酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，均为色谱纯；α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质，美国Sigma公司；试验用水为ddH2O。

1.3 试验样品及来源

真空冻干块菌和真空冻干美味牛肝菌，共22份，由野生食用菌出口企业昆明春鸾商贸有限公司提供，并送昆明植物研究所进行野生食用菌物种外观和DNA条形码检测鉴定，确定其物种名见表1。

表1 样本信息Tab.1 Sample information

1.4 MALDI-TOF-MS对野生食用菌的鉴定方法

1.4.1 蛋白提取方法

分别取15 mg块菌和美味牛肝菌干品放入研钵中，加入适量液氮反应（30±5）s，将块菌和美味牛肝菌干品碾碎转入1.5 mL离心管中；加入 60 μL的 70%甲酸溶液吹打混匀，加入等体积的乙腈，13 000 r·min-1离心 1 min，取上清[5]。

1.4.2 提取液蛋白质浓度测定

Bradford法测定溶液蛋白浓度是一种可靠、快速且敏感的检测方法，考马斯亮蓝G-250试剂有蓝红2种不同颜色的形式，在一定的乙醇及酸性条件下会呈现淡红色，与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，在595 nm紫外波长出有特殊吸收峰，并且在一定范围内呈线性关系，可据此推算蛋白质溶液浓度[14]。

标准曲线的建立：缓冲液按甲酸/乙腈配比1∶1配制；标准液为1 mg·mL-1牛血清白蛋白（BSA）溶液；工作液为将50 mg考马斯亮蓝G-250试剂溶入25 mL无水乙醇中，加入50 mL的85%磷酸，定容至500 mL，使用前滤纸过滤沉淀，每次工作液加样量均为3 mL。测定标准液吸光度值绘制标准曲线，加样量见表2。根据绘制的标准曲线测定不同提取液蛋白浓度。

表2 Bradford法制定标准曲线加样信息表Tab.2 Bradford method to develop standard curve sample loading information table

1.4.3 质谱条件

1）基质溶液的配制。用V（2.5%三氟乙酸的超纯水）∶V（乙腈）=1∶1混合制成的标准溶液，根据样本分子量选择的基质HCCA溶解（1 mg·100-1mL-1）。基质溶液现配现用。

2）吸取1 μL经1.4.1处理的食用菌蛋白提取液滴加到Anchorchip靶板上，干燥后滴加1 μL基质溶液，待完全干燥后放入质谱仪器中检测。用安图公司微生物鉴定校准品进行质谱检测仪器质量准确性校准。

3）Autof ms1000仪器参数设定。推斥极电压20 kV，激光频率60 Hz，质量范围2 000 Da～20 000 Da，离子延时时间230 ns，激光强度35%[5]。

4）图谱采集。用 Autof Acquirer软件对样品点进行图谱采集，每个样品平行滴加3个靶位，每个靶位采集1张谱图，每张图累加3次，每次累加激光击打40次。将不同菌株采集到的图谱分类保存。

1.4.4 图谱分析

用Autof Analyser软件对不同菌株采集的图谱进行比对及聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 提取液蛋白质浓度测定

提取液蛋白质浓度与吸光度值标准曲线见图1。

由图1可知，标准蛋白浓度在0.01 mg·mL-1～0.09 mg·mL-1内存在良好的线性关系，标准曲线方程为y=9.807 5x+0.013 8，测得块菌的提取液蛋白质浓度为0.243 mg·mL-1，美味牛肝菌的提取液蛋白质浓度为 0.284 mg·mL-1。

2.2 不同菌类蛋白指纹图谱分析

由于真菌类蛋白指纹图谱普遍基线强度较高，因此试验所有指纹图谱均为除基线后的谱图。真空冻干美味牛肝菌样本谱图见图2。

从图2可以看出，昆明市禄劝县LN1～LN6样品的主要特征峰质荷比（m/z）分别为：2 682、3 411、4 664、7 041、7 064。楚雄州苍岭镇美味牛肝菌样本 CN1-CN6的谱图特征峰质荷比 （m/z）为：2 327、2 682、3 665、4 664、7 064。图谱结果表明，样本LN与样本CN具有相同特征峰，其质荷比（m/z）为：2 682、4 664、7 064。冻干块菌谱图见图3。

从图3可以看出，楚雄州苍岭镇块菌样本特征峰质荷比（m/z）为：4 078、4 118、9 850。攀枝花块菌样本谱图特征峰质荷比（m/z）为：4 078、4 118、6 113、9 850。冻干块菌样本CS与样本PS具有相同的特征峰质荷比为：4 078、4 118、9 850。

2.3 进化关系分析

将样本图谱用Analyzer软件进行聚类分析，结果见图4。

如图4所示，样本被归为2大类，真空冻干美味牛肝菌昆明市禄劝县（LN）与楚雄州苍岭镇样本（CN）归为一大类；真空冻干块菌楚雄州苍岭镇样本（CS）与攀枝花样本（PS）被归为一大类。

3 结论与讨论

试验研究样本为2个产地的块菌、2个产地的美味牛肝菌，共计22份，以盲样编号方式将样本送至郑州安图实验仪器（郑州）有限公司进行鉴定。样品通过聚类分析分为2类，与物种分类一致。同种菌类谱图具有相同的特征峰，不同菌类谱图间差异峰较大，说明同种食用菌间具有较相似的蛋白质组成，不同食用菌蛋白质具有较大差异。

据统计，全球有多达150万真菌类物种，其种类及数量在自然界中仅次于昆虫。真菌物种丰富多样，在生态系统中发挥着举足轻重的作用，而且其蕴含巨大的食用及药用价值[15]。食用菌作为众多真菌资源中的大型真菌，是云南各地农贸市场上重要的农副产品，块菌和美味牛肝菌是云南省出口创汇的主要品种[6-7]。块菌有独特的香气，滋味极其鲜美，又具保健强身之功，被视为食用菌中的珍品，与鹅肝、鱼子酱并称为世界3大美味[16]。全球迄今共报道60余种块菌，我国现报道26种，其中印度块菌（Tuber indicum Cooke & Massee）为主要贸易食用菌，以出口为主[17]；美味牛肝菌经现代研究证明，其所含的化学成分不仅有良好的营养价值，而且具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血脂和提高人体免疫力等多种药理作用[12]。

为了持续利用云南特色高值野生菌资源，更好的拓展贸易市场，需要对大宗出口的美味牛肝菌和块菌进行快速物种身份甄别。形态学鉴定依赖鉴定者的经验，且对于外观形态已发生改变的制品较难鉴定。

近年来，研究者们采用DNA条形码技术对真菌的分类鉴定展开了大量研究[18-20]，可运用于野生食用菌菌制品，如菌块、菌丝和菌干的物种鉴定，但该鉴定方法难以在短时间内得出结果，而MALDITOF-MS技术可在20 min内完成食用菌物种鉴定，并可对大量野生食用菌实现高通量快速检测。

通过采集不同种属及不同地域的食用菌，利用MALDI-TOF-MS技术收集特征指纹图谱，构建野生食用菌的标准数据库，可进一步对未知的野生食用菌进行分类鉴定，为误食野生菌中毒食品安全事件的调查以及防控提供技术手段。