蛹虫草类胡萝卜素酶法提取和TLC法纯化研究*

卜义明，江晓路，孟 菲，吕秀霞

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

蛹虫草类胡萝卜素是一种水溶性类胡萝卜素，自 2013年Dong[1]从蛹虫草（Cordyceps militaris）子实体中分离纯化得到了4种水溶性的类胡萝卜素（Cordyxanthin-Ⅰ、Cordyxanthin-Ⅱ、Cordyxanthin-Ⅲ、Cordyxanthin-Ⅳ）以来，蛹虫草类胡萝卜素受到了科研人员的广泛关注。类胡萝卜素是无毒无害的天然着色剂，具有抗炎、抗氧化等功效[2]。然而绝大部分类胡萝卜素为脂溶性，不易于人体吸收且对光热不稳定。为提高其相关产品的生物利用度，研究人员提出了采用乳化剂、纳米凝胶、纳米分散体系、微胶囊等多种应对方法[3-6]，无形中增加了类胡萝卜素的开发应用成本。研究表明，蛹虫草类胡萝卜素作为水溶性胡萝卜素，同样具有较强的着色能力以及抗氧化、抑菌等功效[7-9]，并且理论上较脂溶性类胡萝卜素具有更高的生物利用度。因此，蛹虫草类胡萝卜素在食品、医药、化妆品、纺织业等领域都具有广阔的开发和应用前景。

蛹虫草类胡萝卜素的主要提取方法有2种：一类是以丙酮为溶剂的酸热法[10]，使用强酸高温实现细胞破碎的同时很可能也破坏了类胡萝卜素原有结构，并且引入了有毒试剂，不利于食品级蛹虫草类胡萝卜素的开发。另一类是以一定浓度的乙醇水溶液为溶剂的直接浸提[1]或超声辅助浸提法[11]，这两种方法提取效率较低，超声的使用也将增加生产成本，Dong[1]使用超声辅助浸提法得到的蛹虫草类胡萝卜素含量为1 270 μg·g-1，小于张志军[10]使用酸热法得到蛹虫草类胡萝卜素含量（2 158 μg·g-1）。目前，蛹虫草类胡萝卜分离纯化方法报道也较少，主要有硅胶柱层析法[12]和制备型液相色谱法[1]。硅胶柱层析需要反复多次才能达到较好的纯化效果，纯化效率较低；制备型液相色谱纯化过程较多试剂消耗，成本较高；而且这两种方法的操作比较复杂，不利于规模化生产应用。

为了开发一种成本低、效率高、条件温和、操作简便、节能环保的蛹虫草类胡萝卜素的分离纯化方法，对蛹虫草类胡萝卜素的酶法提取及TLC纯化进行了初步研究，以期为蛹虫草类胡萝卜素的进一步开发应用提供技术参考与理论依据。

1 材料与仪器

蛹虫草子实体：购自沈阳聚鑫生物有限公司；脂肪酶：和氏璧生物技术有限公司；蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司；无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；乙腈，TLC薄层板：德国Merck公司；其余试剂均为国产分析纯。

AR224CN型分析天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；L5S紫外可见分光光度计：上海精科仪器有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪：Agilent公司；KQ5200E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HWS-12型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；DFY-400粉碎机：温岭市林大机械有限公司。

2 试验方法

2.1 子实体粉制备及类胡萝卜素吸收光谱绘制

将蛹虫草子实体置于40℃鼓风干燥箱内干燥至恒重，粉碎机粉碎，过60目筛，得子实体粉。

参考Dong[1]方法并做适当调整：准确称取0.5 g蛹虫草子实体粉，加入10 mL的80%乙醇充分混匀，于室温下静置 30 min，4 800 r·min-1离心 20 min，取上清液过0.22 μm微孔膜过滤并于400 nm～500 nm光谱扫描，绘制吸收光谱，得到最大吸收波长。

2.2 蛹虫草类胡萝卜素酶法提取研究

2.2.1 样品酶解前处理的料液比筛选

准确称取1.0 g蛹虫草子实体粉，按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 的料液比 （m∶v）加入蒸馏水，充分搅拌后，观察样品状态。以流动性适中的料液比做为最佳料液比。

2.2.2 酶的筛选

根据Dong[1]得到的4种蛹虫草类胡萝卜素分子量（494.6～536.6）可知该色素为小分子。小分子进出细胞主要受细胞膜的脂双层和膜转运蛋白影响[13]。因此，选择蛋白酶、脂肪酶作为试验用酶，考虑到类胡萝卜素分子多烯链结构的极大不稳定性，为减少pH对蛹虫草类胡萝卜素的影响，最终选定pH 6.0～8.5的6种酶，如表1所示。

表1 备选酶的最适pH和最适温度Tab.1 Optimum pH and temperature of alternative enzymes

另设直接浸提组和超声辅助提取组作为对照组。称取1 g蛹虫草子实体粉，按最佳料液比加入蒸馏水，涡旋混匀。对照组pH不变，将试验组pH调至备选酶最适pH后，把对照组和试验组置于50℃（酶的最适温度）水浴中。待温度恒定，加入0.01 g备选酶（蛹虫草子实体粉干重的1%，确保酶足量），涡旋混匀，酶解1 h。与此同时，对照组分别于50℃下直接浸提和超声辅助提取1 h。用无水乙醇将试验组与对照组溶剂的乙醇含量调成50%[1]，涡旋混匀后在室温下静置1 h。以4 800 r·min-1离心10 min，取上清液测定在最大吸收波长处的吸光值，计算蛹虫草类胡萝卜素含量，选择辅助提取得到蛹虫草类胡萝卜素含量较高的酶作为最佳酶。蛹虫草类胡萝卜素含量（P，μg·g-1）计算公式[10]如下：

式中：A：最大吸收波长处的吸光值；V：提取溶剂的体积（mL）；D：稀释倍数；0.16：类胡萝卜素的提取系数；W：蛹虫草子实体干重（g）。

2.2.3 酶法提取工艺优化

1）酶解时间平衡曲线

称取1 g蛹虫草子实体粉，按最佳料液比加入蒸馏水，涡旋混匀。将pH调至最佳酶的最适pH，置于50℃水浴中，待温度恒定加入0.01 g最佳酶，涡旋混匀并开始计时，分别于0、15 min、30 min、45 min、60 min时迅速加入无水乙醇将溶剂的乙醇含量调成50%，涡旋混匀后在室温下静置1 h。以4 800 r·min-1离心10 min，取上清液测定在最大吸收波长处的吸光值，计算蛹虫草类胡萝卜素的含量。

2）溶剂的乙醇浓度对类胡萝卜素含量的影响

称取1 g蛹虫草子实体粉，按最佳料液比加入蒸馏水，涡旋混匀。将pH调至最佳酶的最适pH，置于50℃水浴中，待温度恒定加入0.01 g最佳酶，酶解到步骤1中得出的酶解平衡时间。迅速加入无水乙醇，分别将溶剂的乙醇含量调成30%、40%、50%、60%、70%，涡旋混匀后在室温下静置1 h。以4 800 r·min-1离心10 min，取上清液测定在最大吸收波长处的吸光值，计算蛹虫草类胡萝卜素的含量。

3）浸提时间平衡曲线

称取1 g蛹虫草子实体粉，按最佳料液比加入蒸馏水，涡旋混匀。将pH调至最佳酶的最适pH，置于50℃水浴中，待温度恒定加入0.01 g最佳酶，酶解到步骤1中得出的酶解平衡时间。迅速加入无水乙醇，将溶剂的乙醇含量调至步骤2中得到的最佳百分比，涡旋混匀后，在室温下分别静置0、30 min、60 min、90 min、120 min，以 4 800 r·min-1离心10 min，取上清液测定在最大吸收波长处的吸光值，计算蛹虫草类胡萝卜素的含量。

2.3 蛹虫草类胡萝卜素TLC纯化法的研究

2.3.1 蛹虫草类胡萝卜素浓缩液的制备

按优化后的提取工艺制备1 000 mL蛹虫草类胡萝卜素粗提液，真空浓缩至200 mL，加3倍体积乙醇，充分搅拌后4 800 r·min-1离心10 min，收集上清液浓缩至100 mL得到浓缩液。

2.3.2 展开剂的选择

参考唐克华[14]的方法，根据蛹虫草类胡萝卜素水溶性的特点以及Dong[1]的流动相配比，选择冰乙酸、水、无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯来配制备选展开剂。取蛹虫草类胡萝卜素浓缩液在距薄层板下端边缘1 cm处划线，线长1 cm，线距1 cm，线数3条，每条上样量10 μL，用备选展开剂分别展开，以条带分离好、不拖尾、间隔均匀的展开剂为最佳展开剂。

2.3.3 蛹虫草类胡萝卜素TLC纯化分析

取蛹虫草类胡萝卜素浓缩液在距薄层板下端边缘1 cm处划线，线长1 cm，线距1 cm，线数10条，每条上样量10 μL，上样总量为100 μL。用最佳展开剂展开，根据可见光下观察到的展开结果，分别刮下薄板上同一Rf值的每个条带，加入50%乙醇 300 μL，充分震荡，10 000 r·min-1离心 5 min，编号收集各条带的溶出液。参考Dong的HPLC方法[1]，用类胡萝卜素浓缩液和收集到的各条带溶出液进行HPLC对比分析。乙腈为溶剂A（0.5%乙酸为溶剂B），0～55 min，溶剂A含量40%～58%；55 min～60 min，溶剂A含量40%～58%；柱温25℃，上样量20 μL（上样前过0.22 μm微孔膜过滤），流速1.0 mL·min-1，检测波长为2.1中得到的最大吸收波长。

2.4 数据处理

使用Excel 2013分析，重复3次，使用SPSS 24通过单因素ANOVA分析数据并表示为平均值±标准差。P＜0.05为显著水平，P＜0.01为极显著水平。

3 结果与分析

3.1 光谱扫描结果

蛹虫草类胡萝卜素在400 nm～500 nm光谱扫描结果如图1所示，检测到最大吸收峰445 nm和2个肩峰420 nm和475 nm，是典型的类胡萝卜素光谱[1，15]。

3.2 蛹虫草类胡萝卜素酶法提取

3.2.1 样品酶解前处理的料液比选择

蛹虫草子实体粉按不同料液比加水后的状态如表2所示。

表2 按不同料液比加水后的样品状态Tab.2 The state of the sample after adding water with different solid-liquid ratio

由表2可知，当料液比为1∶4时，蛹虫草子实体粉被水完全浸润，流动性适中，为酶解提供了适宜的液体环境。因此，选择1∶4为样品酶解前处理的最佳料液比。

3.2.2 酶的筛选

不同酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素含量见图2。

如图2所示，中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶以及脂肪酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素的含量均明显高于（P＜0.05）直接浸提和超声2个对照组，说明这4种酶能对蛹虫草子实体细胞有很好的酶解作用，其中脂肪酶的类胡萝卜素含量高出对照组最为显著（P＜0.01）。可能是因为水溶性的蛹虫草类胡萝卜素分子从胞内释放受细胞膜脂双层的影响较大，所以蛹虫草子实体经脂肪酶降解后，类胡萝卜素的释放更充分。因此，脂肪酶为最佳酶。

3.2.3 酶法提取工艺优化

1）酶解时间平衡曲线

不同酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取含量影响见图3。如图3所示，用脂肪酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素，0～30 min蛹虫草类胡萝卜素含量逐渐升高，30 min时含量达到最大，之后随着时间增加，含量不再有明显变化。说明脂肪酶破碎细胞的效率很高，但时间内就能明显提升蛹虫草类胡萝卜素从胞内释放。30 min以后，酶解已达到平衡，为了节省时间，取30 min为最佳酶解时间。

2）溶剂的乙醇浓度对类胡萝卜素含量的影响

试验结果见图4。

如图4所示，乙醇浓度在30%～60%之间时，蛹虫草类胡萝卜素含量随着乙醇浓度增加而增加，当乙醇浓度在60%时含量最大。当乙醇浓度达到70%时，蛹虫草类胡萝卜素含量迅速下降。可能是蛹虫草类胡萝卜素的极性最为接近60%乙醇水溶液的极性，溶解度最大。因此，选择60%的乙醇作为溶剂的最佳乙醇浓度。

3）浸提时间平衡曲线

不同浸提时间对类胡萝卜素含量影响见图5。

如图5所示，浸提时间在0～90 min范围内，蛹虫草类胡萝卜素含量随着时间增加逐渐提高，在90 min时达到最大值。90 min以后，含量不再有显著变化。说明90 min时，溶剂中的蛹虫草类胡萝卜素溶解度达到饱和。因此，选择90 min为最佳浸提时间。在最佳酶解时间30 min，最佳溶剂乙醇浓度60%，最佳浸提时间90 min条件下，酶法提取蛹虫草类胡萝卜素的含量可达到（1 747.8±17.6）μg·g-1。

综上，得到蛹虫草类胡萝卜素脂肪酶辅助提取最佳工艺为：蛹虫草子实体粉与水1∶4(m∶v)混匀，加入0.1%脂肪酶，于pH 8.0～8.5，50℃条件下酶解30 min；于室温下加入乙醇，将浓度调至60%，浸提90 min；离心收集上清液得到蛹虫草类胡萝卜素粗提液。该工艺的蛹虫草类胡萝卜素含量最高能达到 （1 747.8 ± 17.6）μg·g-1，显著高于直接浸提[（652.3 ± 24.9）μg·g-1]和超声辅助提取 [（661.5 ±41.9）μg·g-1]的蛹虫草类胡萝卜素含量 （P＜0.01）。

3.3 蛹虫草类胡萝卜素TLC纯化

3.3.1 展开剂的选择

蛹虫草类胡萝卜素在不同展开剂中分离的效果见表3。如表3所示，蛹虫草类胡萝卜素浓缩液用配比为0.5%乙酸水溶液∶乙醇∶正丁醇∶乙酸乙酯=12∶8∶24∶36的展开剂展开后，条带分离效果好，间隔清晰，无拖尾。因此，选该配比为最佳展开剂。该配比也说明蛹虫草类胡萝卜素分子具有较强的极性。

3.3.2 蛹虫草类胡萝卜素TLC纯化分析

蛹虫草类胡萝卜素浓缩液经最佳展开剂在TLC板上展开结果见图6。

由图6可知，蛹虫草类胡萝卜素浓缩液TLC板上展开后，可以清晰地分离出4个条带。TLC法纯化蛹虫草类胡萝卜素的HPLC检验结果见图7。

如图7所示，经HPLC对比分析，4个条带溶出液的出峰的时间和顺序分别与Dong[1]发现的Cordyxanthin-Ⅰ、Cordyxanthin-Ⅱ、Cordyxanthin-Ⅲ、Cordyxanthin-Ⅳ的出峰时间顺序一一对应，主峰的峰面积百分比分别为76.10%、95.90%、97.96%、81.53%。由此推测，分离得到的4个条带可能是文献报道的4种蛹虫草类胡萝卜素。为验证这一推测还需借助质谱核磁等仪器对其结构进行解析，见图8。

表3 蛹虫草类胡萝卜素在不同展开剂中分离的效果Tab.3 Separating effect of Cordyceps militaris carotenoids in different developing solvent

4 结论

经过试验对比，使用酶法提取蛹虫草类胡萝卜素，比使用直接浸提法和超声辅助提取法效果更好，其中使用脂肪酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素的含量最高。通过单因素实验，初步优化了脂肪酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素的条件，该工艺条件下得到的蛹虫草类胡萝卜素含量达到 1 747.8± 17.6 μg·g-1，高于Dong[1]使用乙醇为溶剂的超声辅助提取法得到的蛹虫草类胡萝卜素含量（1 270 μg·g-1），结合本研究对比试验的结果可说明酶法提取法具有替代超声辅助提取法提取蛹虫草类胡萝卜的潜力。

由于类胡萝卜素化合物遇光、酸、氧和高温时不稳定、易降解[15]，张杰[11]和高燕燕[16]的研究也表明蛹虫草类胡萝卜素对光、酸、高温不稳定，酸热法不可避免地会对蛹虫草类胡萝卜素造成破坏，并且使用有毒的丙酮作为溶剂还限制了酸热法应用于开发食品级的蛹虫草类胡萝卜素，因此本文未对酶法和酸热法进行试验比较。相比于酸热法，酶法提取的条件更加温和，试剂更安全环保，应用于蛹虫草类胡萝卜素相关食品、药品、化妆品的开发更为可行。至于脂肪酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素的含量低于张志军[13]使用酸热法得到蛹虫草类胡萝卜素含量（2 158 μg·g-1），可能有酶法提取工艺不完善、不同产地不同批次蛹虫草子实体自身类胡萝卜素含量存在差异等诸多因素，这些问题有待进一步研究，可通过响应面分析或正交实验对酶辅助提取工艺进行再优化，或许能进一步提高该工艺的类胡萝卜素得率。

通过比较不同配比的TLC展开剂对蛹虫草类胡萝卜素的分离效果，筛选得到配比为0.5%乙酸水溶液∶乙醇∶正丁醇∶乙酸乙酯=12∶8∶24∶36的展开剂为最佳展开剂，能将蛹虫草类胡萝卜素浓缩液分离成4条清晰的条带。根据HPLC检测结果，推测4个条带分别对应Dong[1]提取得到的4种蛹虫草类胡萝卜素（Cordyxanthin-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）；后续还需进一步对4个条带的成分进行结构解析以证实该推测。相比于使用硅胶柱层析和制备型液相纯化，使用TLC法纯化蛹虫草类胡萝卜素操作更简便，试剂消耗较少，分离速度快，效率高，分离效果直观可见，更具市场前景。但本研究的结果离生产应用还有差距，试验中使用了灵敏度高的分析型TLC板，若改用灵敏度较低的制备型TLC板做量产，可能还需要对展开剂配比进行调整。

天然类胡萝卜素中大多数水溶性都较差，极大地限制了它们在食品、药品等方面的用途。尽管目前已开发出一些将脂溶性类胡萝卜素引入水基体系的方法[17]，但不是总能达到理想的溶解度范围，并且还存在增溶剂有毒的风险[18]。相比于亲脂性高的β-胡萝卜素和番茄红素，亲脂性较低的叶黄素生物利用度更高[19]，因此，蛹虫草类胡萝卜素作为一种罕见的水溶性类胡萝卜素，理论上具有比脂溶性类胡萝卜素更高的生物利用度，在食品、医药、化妆品领域拥有更广阔的开发应用前景。因此，本研究旨在开发一种成本低、效率高、条件温和、操作简便、节能环保的蛹虫草类胡萝卜素的分离纯化方法，为蛹虫草类胡萝卜素的安全绿色开发提供有用参考。