PEG1000-（NH4）2SO4双水相萃取玉米芯黄酮工艺优化及抗氧化性研究

刘 晔

（福建林业职业技术学院，福建 南平 353000）

糯玉米芯作为主要粮食作物玉米的一种加工废弃物，多用于造纸制浆和家畜饲喂[1]，综合开发利用率不高，经研究发现，玉米芯内含有多种生物活性成分，可作为木糖、黄酮、多酚类物质等高附加值产物的原料[2]。黄酮类化合物作为玉米芯中的主要活性物质之一，具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化等药理作用[3]。热回流提取法、超声波提取法、微波提取法等仍然为黄酮类物质最主要的提取方法[4]，但上述方法操作复杂、成本高、易破坏有效成分、不易于连续生产。而双水相作为一种聚合物-盐-水萃取体系具有萃取条件温和，不破坏生物活性，易于连续生产等特点，已被应用于分离色素，生物碱，黄酮以及小分子化合物[5]。本实验通过PEG1000-（NH4）2SO4双水相对糯玉米芯中黄酮进行萃取，探讨其最佳工艺条件，并评价其抗氧化能力，旨在为分离玉米芯黄酮提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯玉米芯采集于南平市郊区；芦丁标准品，江西佰草源生物科技有限公司；Tris，Scientific Phygene；PEG1000、水杨酸 、乙 醇 、（NH4）2SO4、NaCl、NaOH、盐 酸 、Al（NO3）3、NaNO2、L-抗坏血酸、FeSO4、邻苯三酚、30%H2O2，西陇化工股份有限公司。

1.2 设备

UV-1600紫外可见分光光度计，翱艺仪器有限公司；KQ-500E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ST2100 pH计，奥豪斯仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米芯黄酮粗提液制备

将糯玉米芯干燥至恒定质量，粉碎过筛备用。称取糯玉米芯样品粉末2.5 g，75%乙醇作为浸提液，超声提取30 min，离心，得上清液。

1.3.2 绘制芦丁标准曲线

芦丁标准溶液配制成一定浓度，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[6]，于510 nm波长处测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线。

1.3.3 制备双水相体系相图

采用浊点法[7]，将PEG1000溶液置于比色管中，加入一定浓度的（NH4）2SO4溶液混合，直至体系有两相产生，计算此时二者的质量分数，加水破坏两相，重复上述步骤，将数据整合进行相图绘制。

1.3.4 单因素试验设计

将2 mL黄酮粗提液混合在双水相萃取体系中，分别设置总体系中PEG1000质量分数（18%、20%、22%、24%、26%、28%），（NH4）2SO4质量分数 （10%、12%、14%、16%、18%、20%），NaCl添加量（1%、2%、3%、4%、5%），pH 值（2、3、4、5、6、7），恒定体系总质量 10 g，将混合液 3 000 r/min 离心10 min，静置分层[8]，考察这4项因素对玉米芯黄酮在双水相体系中的萃取效用。

式中：M——相比；V上、V下——上、下相体积，mL；K——分配系数；C上、C下——上、下相黄酮浓度，mg/mL。

1.3.5 正交优化筛选

单因素试验结果分析，以玉米芯黄酮萃取率为指标结果，将 PEG1000 质量分数、NaCl添加量、（NH4）2SO4质量分数、pH值为自变量，进行L9（34）正交试验，筛选出玉米芯黄酮最佳萃取工艺参数。

1.3.6 测定抗氧化活性

（1）羟自由基清除作用。参照李小红等[9]方法，以L-抗坏血酸为阳性对照，取浓度分别为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL 的玉米芯黄酮提取液2 mL，与蒸馏水2 mL、2.5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、5 mmol/L FeSO4溶液各1 mL混匀，静置10 min；随即显色反应30 min，在510 nm处测定吸光度。

式中：B0——空白对照吸光度；B1——样品溶液本底吸光度；B2——样品吸光度。

（2）超氧阴离子自由基清除作用。参照单科开等[10]方法，将一定浓度的玉米芯黄酮样品溶液，运用邻苯三酚溶液自氧化法，于325 nm处每隔30 s测定一次吸光度。以L-抗坏血酸为阳性对照，试剂参比为0.01 mol/LHCl溶液。

式中：V1——样品所测吸光度值与时间的线性回归直线斜率；V0——蒸馏水所测吸光度值与时间的线性回归直线斜率。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

测定0.008～0.056 mg/mL芦丁标准溶液的吸光度，回归方程为：y=11.546x+0.0008，R2=0.999 4。

2.2 双水相体系

作为影响两相平衡的主要因素，PEG1000与（NH4）2SO4二者的质量分数数值需位于临界线上方，才能够获得稳定的双水相体系。观察图1曲线，当PEG1000质量分数越大时，（NH4）2SO4含量不宜过低，否则不易形成两相，当PEG1000质量分数为18%时，（NH4）2SO4所需量应高于10%才易形成两相。因此，需选取临界曲线上方适宜的数值才能构建稳定的双水相体系。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 PEG1000质量分数对玉米芯黄酮萃取率的影响

固定萃取体系中（NH4）2SO4质量分数18%，pH值 4，NaCl添加量3%，玉米芯黄酮在PEG1000质量分数为18%～28%范围时的体系中，研究分配系数和萃取率的分配趋势。由图2可知，PEG1000质量分数的增加，增强了两相之间相比，促使玉米芯黄酮富集于上相，提升了上相中黄酮的浓度，分配系数值也发生相应的增加。当PEG1000质量分数超过26%时，体系黏度升高[11]，造成分配系数与萃取率数值降低。因此，体系中PEG1000质量分数在26%时，萃取效果最好。

2.3.2 （NH4）2SO4质量分数对玉米芯黄酮萃取率的影响

玉米芯黄酮在两相间的分配特性也取决于（NH4）2SO4质量分数。图3表明，当其质量分数不高于18%时，萃取率随浓度增加并达到最高值；在18%～20%范围内，随浓度增加而减小。在双水相体系中，（NH4）2SO4质量分数进一步增加，促使体系极性增强[12]，受此作用使上相中黄酮浓度降低，导致萃取率随之下降。故体系中，设置（NH4）2SO4质量分数为18%，萃取效果显著。

2.3.3 NaCl添加量对玉米芯黄酮萃取率的影响

研究NaCl添加量在1%、2%、3%、4%、5%范围内，玉米芯黄酮在两相间的分配情况。由图4可知，NaCl添加量低于3%时，电解质离子在两相间的分配导致两相间电位差增大[13]，有利于玉米芯黄酮萃取率的提高；当NaCl添加量超过3%时，双水相体系极性增强，阻碍黄酮进入上相，导致体系中玉米芯黄酮分配系数与萃取率下降。因此NaCl添加量3%为宜。

2.3.4 pH值对玉米芯黄酮提取率的影响

图5所知，由于pH增大，能引起双水相体系黄酮电荷性质和电位差的改变[14]，影响玉米芯黄酮在上下相中的分配，从而导致玉米芯黄酮分配系数和萃取率随着体系pH值先增加后减小。根据总体趋势，pH值调整为4时最为适宜。

2.4 正交试验结果

依据单因素试验结果，优化双水相萃取体系，将PEG1000质量分数（A）、（NH4）2SO4质量分数（B）、pH 值（C）、NaCl添加量（D）这四项因素进行L9（34）正交试验，从表1可知，影响玉米芯黄酮萃取率各因素的主次顺序为：ABCD，其最优工艺参数：A2B2C2D2，即PEG1000质量分数26%，（NH4）2SO4质量分数18%，pH为4，NaCl添加量3%。进行方差分析可知，PEG1000质量分数对黄酮萃取率具有显著性影响（p0.05）。在该条件下进行验证试验，试验平行3次，可得萃取率平均值为97.39%±0.26%。

表1 正交试验结果及分析Tab.1 Results and analysis of orthogonal test

表2 方差分析表Tab.2 Analysis results of variance

2.5 抗氧化活性结果

2.5.1 羟自由基清除作用

玉米芯黄酮对羟自由基清除率，见图6。

图6 所示，随玉米芯黄酮浓度增加，对羟自由基清除效果呈直线上升趋势，当玉米芯黄酮、L-抗坏血酸浓度为0.6mg/mL时，对羟自由基清除率分别为70.28%和86.90%，二者之间有轻微差异。

2.5.2 超氧阴离子自由基清除作用

图7表明，玉米芯黄酮浓度的增加，对超氧阴离子自由基清除效果呈总体提升趋势。当玉米芯黄酮、L-抗坏血酸浓度为0.5 mg/mL时，清除率分别为67.94%和86.05%，其清除能力低于相同浓度的L-抗坏血酸。

3 结论

通过正交实验优化PEG1000-（NH4）2SO4双水相体系萃取玉米芯中黄酮工艺，确定PEG1000质量分数为26%，（NH4）2SO4质量分数为18%，pH值为4，NaCl添加量为3%为最优工艺参数。在此工艺参数下，其萃取率可达97.39%±0.26%，优于传统的超声波浸提法，可作为一种更高效、稳定的提取方法。同时，对羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力上，主要取决于玉米芯黄酮的浓度，随添加量呈直线上升趋势。这为进一步综合开发利用玉米高附加值产物提供了一定的理论参考。