[18F]-苯丙氟硼酸的制备工艺改进及初步临床应用

周 明，李玉来，杨能安，李 建，陈小娟，胡 硕

(1.中南大学湘雅医院 PET中心，湖南 长沙 410008；2.湖南省肿瘤医院 药学部，湖南 长沙 410013)

氨基酸是肿瘤增殖过程的必需营养物质，利用放射性核素标记氨基酸类似物作为显像剂，对肿瘤进行特异性显像是近些年的研究热点[1-4]。由于氨基酸结构的特殊性，用11C或18F直接标记产率低、稳定性差[5]，而Al18F、68Ga、99mTc等都会对原有分子结构有较大改变，容易导致标记分子的靶向性降低、毒性变大[6]。氟硼酸结构是一种与α-氨基酸结构极其类似的结构，研究表明，用氟硼酸结构取代α-氨基酸结构后化合物的药代行为与原来氨基酸非常相似，因此可以用氟硼酸类化合物代替氨基酸类化合物进行放射性标记用于肿瘤的显像研究[7-9]。

目前18F标记氟硼酸类显像剂主要采用氨基聚醚碳酸钾溶液进行淋洗，通过固相萃取纯化，产率较低，终末产品需要检查氨基聚醚和乙腈等有害物质的残留[9]。本研究拟对现有的标记工艺进行部分优化，以获得更加安全、高效的放射性18F标记氟硼酸类显像剂，并研究其在U87 MG细胞中的摄取情况，及在健康受试者体内分布情况，为下一步的临床应用奠定基础。

1 设备与材料

1.1 设备

PET/CT:美国GE Discover Elite；回旋加速器：美国GE Qilin；氟多功能药物合成模块：派特(北京)科技；Radio-TLC仪：美国 Bioscan公司；CRC-25R 型活度计：美国 Capintec公司；Radio-HPLC仪、分析型C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)：美国Agilent 公司；γ放射免疫分析仪：北京核海高技术有限公司。

1.2 材料

标记前体苯丙氟硼酸由陈小元教授和刘志博教授惠赠；氨基聚醚(kryptofix2.2.2, K2.2.2)/K2CO3溶液：派特(北京)科技；Sep-Park Light Al2O3柱、Sep-Park Light C18柱：美国Waters公司；Millex.GS无菌过滤器(0.22 μm)：美国Millipore公司；色谱纯乙腈：上海凌峰化学试剂有限公司；18O-H2O：江苏华益；U87 MG细胞：中南大学细胞实验中心。

2 实验方法

2.1 对照组苯丙氟硼酸常规标记方法

1)采用GE公司Qilin医用质子回旋加速器进行18O(p，n)18F反应生成18F-，加速器束流为50 μA，轰击时间为20 min；2)将步骤18F-经管道传输至Sep-Park Light QMA上并被QMA捕获；3)反应管中加入0.2 mL浓度为500 mmol/L的苯丙氟硼酸乙醇溶液和0.2 mL pH为2.5的哒嗪-盐酸缓冲液；4)用K2.2.2/K2CO3的混合溶液0.5 mL18F-淋洗至安瓿瓶中，并取100 μL加入到反应瓶中；5)80 ℃条件下苯丙氟硼酸溶液与18F-进行核素交换反应(如图1);6)20 min后反应体系加入去离子水5 mL进行淬灭反应；7)淬灭反应后的体系直接过Sep-Park Light C18柱纯化，并用10 mL水清洗C18柱；8)用50%的乙醇溶液5 mL淋洗C18柱即得[18F]-苯丙氟硼酸溶液([18F]-Phe-BF3)。

图1 [18F]-苯丙氟硼酸合成路线图

2.2 实验组苯丙氟硼酸标记方法

1)18F-生产与捕获方式与实验组相同，反应管中加入0.2 mL浓度为500 mmol/L的苯丙氟硼酸乙醇溶液；2)用pH=2的盐酸氯化钠溶液0.5 mL将18F-淋洗至安瓿瓶中，并取100 μL加入到反应瓶中；3)80 ℃条件下苯丙氟硼酸溶液与18F-进行同位素交换反应；4)20 min后反应体系加入5 mL去离子水进行淬灭反应；5)淬灭反应后的体系直接过Sep-Park Light Al2O3柱纯化得产品溶液，比活度为(6.11±0.25)MBq/μmol。

2.3 [18F]-苯丙氟硼酸质量控制

对产品溶液的理化性质、放化纯度、细菌、内毒性等质控指标进行测定(参考2015版药典)。对比放射性产物[18F]-苯丙氟硼酸与反应原料[19F]-苯丙氟硼酸(标准品)HPLC保留时间，确定放射性产物纯度的流动相为0～2 min，5%乙腈；2～10 min，20%乙腈；10～15 min，100%乙腈。

2.4 细胞摄取实验

为了确定显像剂[18F]-苯丙氟硼酸是否与肿瘤细胞有靶向性，选用U87 MG人胶质瘤细胞，分为三组，其中实验组为[18F]Phe-BF3，阻断组为[18F]-Phe-BF3+Phe-BF3，游离18F-为对照组。实验组细胞经PBS清洗三次，加入显像剂[18F]-Phe-BF32.96 MBq，孵育1 h，再用PBS清洗三次后加0.5 mL 1 mol/L NaOH，最后收集细胞液测γ计数；阻断组细胞经PBS清洗三次，加入Phe-BF3(500 mg/L)，孵育0.5 h后，加显像剂2.96 MBq，再孵育1 h，然后PBS清洗三次后，加0.5 mL 1 mol/L NaOH，收集细胞液测γ计数；对照组加游离18F-2.96 MBq，孵育1 h，PBS清洗三次后加0.5 mL 1 mol/L NaOH，最后收集细胞液测γ计数。各组保持最终体积一致。

2.5 PET显像

2.5.1受试人群 共招募志愿者3人，其中男性1人，女性2人，年龄在56～60岁，中位年龄57岁，3人体检无器质性疾病。该项目已通过医院伦理委员会批准(201601007)，检查前告知受检者并签署知情同意书。

2.5.2显像方法 受检者仰卧于PET/CT检查床，静脉注射[18F]-苯丙氟硼酸4.44 MBq/kg后，分别于5、15、30、45、60、75、90 min，分别进行PET/CT静态扫描，先进行CT扫描，扫描范围及顺序为脑部-盆腔，然后立即进行PET采集，采集范围同CT，采集顺序为盆腔-脑部，共8个床位，每个床位15.7 cm，每个床位间重叠3.7 cm，PET采集方法采用3D-TOF序列，CT扫描管电压为120 kV、自动mAs、螺距为0.984∶1、矩阵512×512，PET矩阵256×256，CT及PET层厚均为3.75 mm。

2.5.3图像重建和数据处理 PET图像重建均用有序子集最大期望值迭代(OSEM)法，得到三维图像及横断、冠状、矢状断层图像。将PET和CT图像传到GE AW 4.6后处理工作站，进行帧对帧图像对位融合，在健康志愿者脑、肺、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、肾实质、膀胱、肌肉及骨髓等处分别勾画感兴趣区(ROI)的放射性摄取，取ROI区内放射性计数平均值即平均标准摄取值(SUV)，所有ROI测量3次取平均值，计算SUV，根据公式SUV=病灶的放射性浓度(kBq/mL)/注射剂量(MBq)/体重(kg)，由AW 4.6后处理工作站完成。

3 实验结果

3.1 质量控制

1)理化性质：各三批产品均为无色透明溶液，pH 均为6到7之间。2)K2.2.2残留：对照组产品溶液中K2.2.2均大于50 mg/L。3)细菌内毒素：参考2015版药典进行细菌、内毒素检测，结果表明，细菌和内毒素均未检出。4)放化纯度：实验组产品溶液利用HPLC检测纯度，实验结果表明产品化合物放化纯度大于99%，无明显杂质峰(如图2)。

3.2 放化产率对比

实验组和对照组各实验三次，结果对照组产率为(4.16±0.26)%，实验组产率为(10.26±0.42)%(P=0.000 03)，差异具有统计学意义，如表1所示。

图2 [18F]-苯丙氟硼酸产品溶液放化纯度HPLC图谱

表1 [18F]苯丙氟硼酸产率比较

注：对照组和实验组差异显著，P<0.01

3.3 细胞摄取实验

孵育1 h后，U87 MG人胶质瘤细胞系[18F]-Phe-BF3计数率为：实验组(9.6±1.5)/min-1，阻断组(7.5±1.1)/min-1，游离18F对照组(4.4±0.9)/min-1。计算摄取值，实验组与阻断组(P=0.007)、实验组与游离18F对照组(P=0.008)的差异均具有显著统计学意义(图3)。

3.4 PET显像

3名健康志愿者均成功完成显像。注射显像剂后随访至24 h(10个半衰期)，志愿者均未出现任何不良反应。受试者注射显像剂5、10、15、30、60、90 min后显像，可见5 min时显像剂在心、肝、脾、胰腺、骨髓等脏器浓聚，随着时间延长，在心脏、肝脏、脾脏、胰腺、肾实质及骨髓中摄取随时间逐渐减低，至30 min后接近本底(图4)。而[18F]苯丙氟硼酸在不同时相人体脑组织及肺组织中放射性摄取均很低(图5)，表明该显像剂在正常脑组织中本底低，有利于显示高摄取的病灶，同时该显像剂主要通过泌尿系统排泄，在肾盂、输尿管及膀胱中呈高摄取。

图3 [18F]-苯丙氟硼酸细胞摄取实验

图4 [18F]-苯丙氟硼酸在人体动态PET显像图

a——PET image;b——CT image;c——PET/CT image; d——PET/CT whole-body image

4 讨论

本研究首次尝试在[19F]氟硼酸标记过程中，用盐酸氯化钠溶液洗脱18F-，既避免了为保证反应浓度对反应18F-的浓缩，也避免了将18F-传输至浓缩管再转至反应管过程中的损失；同时，采用盐酸氯化钠溶液作为淋洗18F-溶液，不仅可以很好的实现对18F-的淋洗，还保证反应过程中的酸性要求。此外，盐酸氯化钠溶液作为18F-淋洗液，相比氨基聚醚碳酸钾溶液明显具有更高的安全性，反应体系也无需额外纯化步骤，经简单的直接稀释过柱即可直接用于人体，安全系数高，而且产品无需检查氨基聚醚和乙腈等有机物的残留。

细胞摄取实验结果中，加[19F]-苯丙氟硼酸作为抑制剂的实验组与单纯的[18F]-苯丙氟硼酸实验组相比细胞摄取计数差别不是很大，原因有可能是[18F]-苯丙氟硼酸产品溶液中的[19F]-苯丙氟硼酸含量高，因为核素交换反应一般产率都不高，而且反应前体与产品因为结构一样也很难纯化分离，产品[18F]-苯丙氟硼酸中含有的部分[19F]-苯丙氟硼酸已经对细胞摄取产生了较强的抑制作用，再额外加入[19F]-苯丙氟硼酸作为抑制剂效果可能不太明显。

通过健康志愿者18F-苯丙氟硼酸PET/CT连续显像发现，该显像剂在正常脑组织中所有采集时像中放射性摄取均很低，表明该显像在正常脑组织中本底很低，而通过细胞摄取实验发现U87 MG人胶质瘤细胞能特异性摄取[18F]-苯丙氟硼酸，因此可以预见胶质瘤将呈高的放射性摄取，而这将为临床胶质瘤诊断提供有力的影像学支持。同时，[18F]-苯丙氟硼酸在肺组织中分布较少，而在心脏、肝脏、脾脏、胰腺、肾实质及骨髓中摄取随时间逐步减低，至30 min后基本接近本底，说明注射显像剂后30 min即可以开始显像。[18F]-苯丙氟硼酸主要通过泌尿系统排泄，因此检查结束后大量饮水可以让显像剂尽快排出体外，减少人体所受辐射。人体动态显像提示，该显像剂能够较快的进行代谢分布，并且全身实质脏器摄取较低，主要通过泌尿系统排泄，提示[18F]-苯丙氟硼酸未来用于临床显像时背景干扰小，很可能作为一种有效的新型显像剂用于临床研究。