全红杨组织培养与快速繁殖技术研究

纪纯阳，杨成超，矫丽曼

(辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115213)

全红杨Populuseuramericanacv.‘quanhong’又称中华全红杨，是原中红杨(P.euramericanacv.‘zhonghong’)二次芽变彩叶新品种[1]，是落叶乔木，喜温，单叶互生，雌雄异株。该品种已经通过了河南省林木新品种审(认)定，并已申请了国家植物新品种保护[2]。全红杨整个生长期叶片都为红色，叶脉和叶柄也呈红色，光泽亮丽，色感极佳。全红杨叶片大而厚，环保无飞絮，隔噪效果好，吸尘性强，观赏价值极高，是彩叶类红叶树种中的佼佼者[3]。全红杨属高大彩叶乔木，适用性强，在城市道路和园林景观绿化中被广泛应用，极具发展潜力，是其它彩叶树种所无法比拟的。

20世纪60年代，国外开始进行杨树组织培养研究，我国于70年代开始研究。随着杨树组织培养技术日益成熟，已被广泛用于杨树多个派别无性系组培快繁研究，我国学者对香杨[4]、大青杨[5]、欧美杨渤丰1号杨[6]、725杨[7]、山新杨[8]、小黑杨[9]、巨霸杨[10]、辽宁杨[11]、盖杨[12]、欧美杨111号[13]等不同派别杨树无性系进行了大量试验研究，建立了组织培养再生体系。近年来，许多学者对全红杨叶色呈色机理、嫁接繁育、栽培技术等方面进行研究，取得了很大成绩。研究发现全红杨存在返祖现象，返祖率达0.2%～0.3%，生长速度相对较慢[14]。目前未见全红杨组织培养方面的报道。本文开展了全红杨组织培养和快速繁殖技术研究，为建立全红杨组织培养与快繁系统、选育杨树良种、种质资源保存、扩大栽培与推广等提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年7月，在盖州市团山镇任屯村辽宁省杨树研究所院内试验圃地，选择1年生健壮无病虫害的全红杨扦插苗，从幼嫩叶片上剪取叶柄(稍带叶片)。

1.2 试验方法

1.2.1 研究材料预处理[12，15]

采回的叶柄用流动的自来水冲洗数次至干净，在无菌室内用75%酒精溶液冲洗3次后浸泡30 s，再用无菌水冲洗3次，放入无菌超净工作台内，用0.1%HgCl2浸泡6 min，不停地用无菌镊子搅拌，最后用无菌水冲洗数次，用吸水滤纸吸干水分，将叶柄剪成1 cm左右的小段，其两端用无菌剪刀剪掉，即获得无菌外植体。

1.2.2 愈伤组织诱导培养基的优化[16-17]

基础培养基为MS，加入不同质量浓度的6-BA(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)和NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1)，附加蔗糖25.0 g·L-1、琼脂6.0 g·L-1，pH值6.0，将已灭菌的外植体接种于诱导培养基中。每隔24 h观察记录愈伤组织的分化情况。每种培养基接种30个培养物，每个三角瓶接种3块培养物。

1.2.3 不定芽分化培养基的优化[18-19]

基础培养基为MS，加入不同质量浓度的6-BA(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)，附加蔗糖30.0 g·L-1、琼脂6.0 g·L-1，pH值6.5，将生成大块愈伤组织的外植体用无菌剪刀剪成1 cm3的小块，接种于培养基中，每隔48 h观察记录不定芽发育情况。每种培养基接种25块愈伤组织，每个三角瓶接种5块愈伤组织。

1.2.4 生根培养基的优化[4，20]

基础培养基为MS和1/2MS，加入不同质量浓度的IBA(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)，附加蔗糖20.0 g·L-1、琼脂6.0 g·L-1，pH值6.0，从分化培养基选取高2～3 cm的不定芽，沿不定芽基部剪下接种于生根培养基中，每隔24 h观察记录不定芽生根情况，计算平均生根数和生根率。每种培养基接种24个不定芽，每个三角瓶接种2～3块培养物。

1.2.5 培养条件[21]

将接种后所有培养物置于恒温有光照的培养室内进行培养，温度(25±1) ℃，室内光照强度2 000～2 500 lx，每天6：00-20：00进行光照。

1.2.6 生根组培苗栽培[11，22]

待苗高5 cm以上时，选择根系发达、长势好的生根苗进行容器移栽。待生根苗高20～30 cm时，移栽到试验育苗地。育苗地选择土壤肥力好、疏松、排水良好，易于灌溉的壤土或沙壤土。

1.2.7 数据处理

采用Microsoft Excel 2007处理数据。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导培养基的筛选

7 d后叶柄两端剪切口处开始膨大，叶柄逐渐膨胀伸长，10 d后叶柄表面形成红褐色的愈伤组织，随后愈伤组织不断增殖，体积逐渐膨大，呈红褐色。从表1可以看出，分化叶柄数24～29个，诱导时间7～11 d，诱导率80.00%～96.67%，最佳激素组合为6-BA 0.2 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1，7 d诱导率96.67%。由此确定全红杨叶柄愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.2 mg·L-1+NAA0.05 mg·L-1+蔗糖25.0 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，pH值6.0。

表1 叶柄愈伤组织诱导情况

2.2 不定芽分化培养基的筛选

叶柄在愈伤组织培养基上培养1个月左右，选择松脆呈嫩红色的愈伤组织转移至不定芽分化培养基中培养，10 d后愈伤组织由红色变成绿色，20 d后分化出许多嫩绿色小芽点，25 d分化出多而密的丛生芽。转接1次后不定芽在分化培养基中抽茎展叶，呈深绿色。

由表2可见，从接种第25 d开始，平均分化芽9.6～17.8个，分化率80%～100%。最佳组合为6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1，开始分化时间25 d，平均分化芽17.8个，平均分化率100%。因此确定全红杨最佳不定芽分化培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，pH值6.5。

2.3 不定芽生根培养基的筛选

从接种第16 d开始不定芽生根，生根的不定芽18～24个，平均生根7.8～13.5条，生根率75%～100%(表3)。当IBA浓度相同而基础培养基不同时，1/2MS培养基中的不定芽平均生根数和生根率均高于MS培养基。无论MS或1/2 MS培养基，当基础培养基相同时，随着IBA质量浓度增大，不定芽平均生根数和生根率均先增大后减小。全红杨最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.3mg·L-1+蔗糖20.0 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，pH值6.0。

表2 叶柄不定芽分化情况

表3 不定芽生根情况

2.4 组培苗移栽

2.4.1 室内移栽

根系发达、高5 cm以上的组培苗，打开瓶半封膜，适应室内环境2～3 d。用镊子夹取组培苗，用常温清水轻轻洗去根系上附着的培养基，剪掉较长根系，移栽在装有灭菌基质(腐殖土∶大田土∶河沙=1∶1∶1)的营养杯中，使苗木根系均匀分布于培养容器内，放在室内培养，定期浇水，保持基质湿润。光照强烈时用遮阳网遮光保湿，保证栽培基质含水量75%，控制空气湿度75%～90%。

2.4.2 大田移栽

待容器生根苗高20～30 cm时，移栽到育苗试验地，选择土壤肥沃、通气性好、灌溉方便的地块。一般7-8月份移栽，最好在傍晚或阴天进行，移栽前浇足底水。移栽时去掉外面的容器，将容器内的基质一起栽植于大田，栽后及时浇水。

3 结论与讨论

本研究以全红杨叶柄为外植体，建立了全红杨组织培养与快繁体系。采回叶柄用流动的自来水冲洗，用75%酒精冲洗3次后浸泡30 s，用无菌水冲洗3次，然后用0.1%HgCl2溶液浸泡6 min灭菌。诱导愈伤组织用2，4-D、NAA[23]，本研究用NAA和6-BA配合使用诱导愈伤组织，当6-BA质量浓度为0.2 mg·L-1、NAA为0.05 mg·L-1时，愈伤组织诱导率最高96.67%。试验还剪取叶片为外植体，而叶片均未诱导出愈伤组织，可能是灭菌时HgCl2溶液浸泡时间长或培养基激素配比不合适造成的。细胞分裂素可促进植物细胞的分裂和不定芽的形成，不定芽分化与NAA和6-BA的比值有关，常采用NAA和6-BA来诱导杨树不定芽的分化，其再生率高。当NAA/6-BA≥1/10时，会促进不定芽分化。本研究在诱导不定芽分化时，培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，分化芽数最多，长势好，分化率最高，分化效果最好。全红杨愈伤组织在不定芽分化培养基上经过一个由红褐色转为浅绿色的过程，因此分化时间稍长，全红杨只有在自然光照射下才呈现红褐色，而在人工光源或模拟光源照射下为绿色。培养基中无机盐减半会促进不定根的发育，使用1/2MS基本培养基进行生根培养的效果好于MS基本培养基，诱导生根用IBA效果最好[24]，IBA质量浓度会影响根细胞的分化，低质量浓度有利于根细胞分化，较高质量浓度会对根分化产生胁迫，阻碍根的生成。本研究在IBA质量浓度相同时，1/2MS基础培养基中不定芽平均生根数和生根率均高于MS基础培养基，生根效果好。当基础培养基相同时，随着IBA质量浓度增大，平均生根数和生根率均先增大后减小，可见低质量浓度IBA有利于根细胞的分化，较高质量浓度IBA阻碍根的生成。

通过试验得到全红杨组织培养的最佳配方：愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖25.0 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，pH值6.0；不定芽分化培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，pH值6.5；生根培养基为1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20.0 g·L-1+琼脂6.0 g·L-1，pH值6.0，为今后进行杨树良种选育、种质资源保存、扩大栽培与推广等提供研究基础。