包装饮用水中铜绿假单胞菌4种鉴定方法的比较

王 萍，朱 渊，乔勇升，张占林

(江苏省泰州市药品检验院，江苏 泰州 225300)

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是一种重要的革兰氏阴性致病菌，广泛存在于自然界中,营养要求低，喜欢潮湿的环境，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病[1]。刚出厂的包装饮用水中铜绿假单胞菌数量较少，但因其消费周期较长，保存期至少半个月以上，兼性化能自养代谢而对有机营养要求低的铜绿假单胞菌可生长繁殖达到104cfu/mL[2]。2015年更新实施的GB 19298—2014《食品安全国家标准包装饮用水》在原有微生物限量方面增设了铜绿假单胞菌5次抽样作为检测指标。近年来，随着国内桶装饮用水消费量的不断上升，有关铜绿假单胞菌污染桶装水的报道也逐渐增多[3-7]，引起了诸多学者和消费者的关注。

GB 8538.57—2016是饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌的检验方法，但日常的检测工作中却发现该方法不是很完善，给检验工作带来一定的困扰，张帆等[8]研究发现根据GB 8538.57—2016鉴定出的铜绿假单胞菌中会出现假阳性或假阴性结果；潘盂泉[9]指出其24～48 h的培养条件经常无法对铜绿假单胞菌进行准确计数。本文中，笔者采用GB 8538.57—2016、VITEK 2 Compact、API 20E、16S rRNA基因序列分析4种常用的检测方法对从桶装水中分离得到的菌落形态可疑的25株野生型菌株进行复核验证鉴定，并对鉴定结果进行比较、分析，旨在对铜绿假单胞菌的快速分离与准确鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

铜绿假单胞菌CGMCC1.10274购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其余YS-465等共25株菌株为笔者按照国家标准GB 8538.57—2016饮用天然矿泉水检验方法从桶装水样品中分离保存的野生型菌株。

1.2 仪器与试剂

营养肉汤、平板计数琼脂、CN假单胞选择性培养基，北京陆桥技术有限责任公司；乙酰胺肉汤、纳氏试剂，北京陆桥技术有限责任公司和广州环凯有限公司各买一套；Taq酶等PCR试剂，大连宝生物工程有限公司；16S rRNA引物序列，上海生工生物有限公司合成；Tween 20，上海生工生物公司；革兰氏阴性细菌鉴定卡(GN鉴定卡)及肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(API 20E)，梅里埃生物有限公司；QIAxcel高解析DNA分析试剂盒，QIAGEN公司。所有培养基和试剂均在有效期内使用并通过了质量验收。

VITEK 2 Compact微生物鉴定仪，法国梅里埃生物有限公司；PCR仪，默飞世尔科技公司；QIX核酸蛋白分析仪，QIAGEN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

从标准菌株CGMCC1.10274、YS-465、YS-534、YS-536、YS-635、YS-682、YS-685、YS-686、YS-711、YS-2504、YS-2508、YS-2511、YS-3365、YS-3366、YS-3367、YS-463、YS-531、YS-535、YS-574、YS-634、YS-923、YS-1066、YS-1104、YS-1498、YS-1499及YS-2505共25株野生型菌株的保藏管中各挑取一环菌液，分别划线接种于平板计数平板上，36 ℃过夜培养复苏菌株，然后继续传代一次，得到活化菌株备用。

1.3.2 乙酰胺肉汤试验

将活化的纯培养物分别接种到陆桥和环凯两个不同厂家的乙酰胺液体培养基中，36 ℃过夜培养20～24 h，按照厂家说明书向每个培养物中滴加1～2滴纳氏试剂，立刻观察，若出现砖红色，则为阳性，否则为阴性。每株菌株重复进行3次实验。

1.3.3 VITEK生化鉴定

按照VITEK 2 Compact全自动生化鉴定系统操作流程及GN卡使用说明书对分离保存的野生型菌株进行鉴定，每株菌株重复3次上机实验。

1.3.4 API 20E试剂盒生化鉴定

具体操作按照API 20E试剂盒使用说明书操作，最后将生化结果输入鉴定软件得到鉴定结果。每株菌株重复进行3次实验。

1.3.5 菌落PCR扩增16S rRNA

将3种方法都鉴定为铜绿假单胞菌的13株菌株、3种方法鉴定结果不一致的6株可疑菌株和标准菌株CGMCC1.10274进行16S rRNA PCR扩增。16S rRNA引物序列：27f：5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′，1492R：5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′[10]。扩增体系(25 μL)如下。模板：用一次性接种针挑少量菌体，10×Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，20%吐温(Tween 20/无菌水：V/V)2 μL，正反向引物(10 μmol/L)各为1.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，此步骤共35个循环；最后25 ℃冷却5 min。所得PCR产物通过QIX核酸蛋白分析系统检测。

1.3.6 测序比对及系统发育树的构建

16S rRNA由上海生工生物工程有限公司完成测序工作，并在NCBI上用BLAST进行同源性比较。从GenBank核酸序列数据库中下载铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，MH368491.1)、恶臭假单胞菌(P.putida，AB681323.1)和荧光假单胞菌(P.fluorescens，MG576181.1)的16S rRNA基因序列，与铜绿假单胞菌标准菌株CGMCC1.10274及被GB 8538.57—2016、VITEK 2 Compact及API 20E这3种方法都鉴定为铜绿假单胞菌和可疑铜绿假单胞菌菌株的序列，用Clustal X和TreeViewX生物学软件进行序列比对并构建系统发育树[11]。

2 结果与分析

2.1 GB 8538.57—2016饮用天然矿泉水检验铜绿假单胞菌结果

按照GB 8538.57—2016标准，CN培养基上只有蓝/绿色菌落不需要做乙酰胺肉汤确证性实验，其他的产荧光(非蓝/绿)菌落以及红褐色菌落都需要做乙酰胺肉汤确证性实验，由此可见乙酰胺肉汤实验是铜绿假单胞菌鉴定的一个重要生化指标。为了防止实验过程中所产氨的挥发对实验结果的影响，实验选取环凯(培养基装在无盖的安瓿瓶中培养)和陆桥(培养基装在带盖的西林瓶中培养)2个厂家的乙酰胺肉汤进行试验比较，结果如表1所示。从表1中可以看出，2个厂家的实验结果完全一致，表明这25株野生型菌株不存在由于微弱产氨，通过无盖的安瓿瓶挥发到空气中，造成假阴性的结果。根据GB 8538.57—2016可以判定25株野生型菌株中，14株浅黄色产荧光乙酰胺肉汤阳性的菌株被鉴定为铜绿假单胞菌。

表1 GB 8538.57—2016鉴定结果

注：“+”为阳性结果;“-”为阴性结果。

2.2 VITEK 2 Compact鉴定结果

标准菌株及25株野生型菌株VITEK 2 Compact生化鉴定结果见表2。由表2可知，19株菌株被鉴定为铜绿假单胞菌，其中YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498这5株菌株虽然乙酰胺肉汤实验为阴性，但却被鉴定为铜绿假单胞菌，与按照GB 8538.57—2016检验方法鉴定的结果不一致。

2.3 API 20E生化鉴定结果

标准菌株及25株野生型菌株API 20E鉴定结果见表2。由表2可见，13株被鉴定为铜绿假单胞菌的野生型菌株，与GB 8538.57—2016检验方法及VITEK生化鉴定的结果一致；YS-463、YS-535、 YS-923、YS-1066、YS-1498这5株野生型菌株被鉴定为荧光假单胞菌，与GB 8538.57—2016检验方法判定结果一致，但VITEK2 Compact却鉴定为铜绿假单胞菌；YS-686被鉴定为恶臭假单胞菌，但GB 8538.57—2016及VITEK2 Compact却鉴定为铜绿假单胞菌。

表2 VITEK 2 Compact及API 20E鉴定结果

注：“+”为铜绿假单胞菌;“-f”为荧光假单胞菌;“-p”为恶臭假单胞菌;“-s”为少动鞘氨醇单胞菌;“-ab”为鲍氏不动杆菌;“-ah”为溶血不动杆菌。

2.4 16S rRNA PCR扩增

16S rRNA PCR扩增结果见图1。由图1可知，片段约为1 450 bp，与预期结果相符。

图1 铜绿假单胞菌和可疑铜绿假单胞菌的 毛细管凝胶电泳结果Fig.1 Capillary gel electrophoresis of P. aeruginosaand suspected P. aeruginosa strains

2.5 16S rRNA基因序列比对结果

将3种方法都鉴定为铜绿假单胞菌的13株菌株、3种方法鉴定结果不一致的6株可疑菌株和标准菌株CGMCC1.10274的16S rRNA基因序列经与NCBI数据库上BLAST程序同源性比较，结果与API 20E鉴定结果一致，证实只有13株为铜绿假单胞菌。通过比对序列发现可疑菌株YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498和MG576181.1荧光假单胞菌序列基本一致，YS-686和AB681323.1恶臭假单胞菌序列基本一致，其余菌株和铜绿假单胞菌CGMCC1.10274的基因序列基本一致，结合细菌16S rRNA的9个可变区，发现序列之间的差异正好落在可变区内，如图2所示。通过系统发育树图3，也可以看出13株野生型铜绿假单胞菌与标准菌株CGMCC1.10274聚在一起，YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498 5株菌株与荧光假单胞菌(MG576181.1) 聚为一类，而YS-686与恶臭假单胞菌(NBRC 100988)聚为一类。

图2 16S rRNA基因序列差异Fig.2 The difference of 16S rRNA sequence

图3 基于16S rRNA基因序列的铜绿假单胞菌和 可疑铜绿假单胞菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence ofP. aeruginosa and suspected P. aeruginosa strains

3 讨论

由于物种间高度的保守性，16S rRNA基因序列被称为“细菌化石”，目前已被广泛应用于遗传进化分子水平上对细菌进行鉴定[12-14]。本文中其他3种方法与16S rRNA基因序列比对结果相比，GB 8538.57—2016鉴定结果中，1株为假阳性菌株，所占比例为7.14%；VITEK 2 Compact鉴定结果中，6株为假阳性菌株，所占比例为31.58%；API 20E鉴定结果与16S rRNA基因序列比对鉴定结果一致，表明API 20E对铜绿假单胞菌的鉴定结果是准确和可靠的。

GB 8538.57—2016中对铜绿假单胞菌的进一步确认主要通过乙酰胺试验，铜绿假单胞菌具有乙酰胺酶，能够分解乙酰胺产氨。但已有研究显示粪链球菌、洋葱假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌的部分菌株也具有乙酰胺酶，产氨试验也为阳性[15]，于是造成了一些假阳性结果的产生，如本文中的YS-686菌株。

VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统以方便、快捷、准确率高著称，是绝大多数微生物实验室、微生物工作者以及国家标准都认可的仪器，甚至以此仪器作为微生物鉴定是否准确的判断依据，但陈冠武等[16]在检测化妆品中铜绿假单胞菌时发现一株假阳性菌株，在本研究中也发现假阳性菌株，所占比例达31.58%。这可能与VITEK 2 Compact属于表型鉴定有关，接种物的浓度，培养液的组分、孵育时间，细菌本身的一些不典型性以及仪器光学读数头等其他一些因素都会影响最终生化鉴定结果[17-18]。此外，本次试验所选可疑菌落中浅黄色发荧光居多，与假单胞属中常见黄色、发荧光的荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌易互相干扰，导致本次鉴定假阳性所占比例较高。

4 结论

GB 8538.57—2016虽是目前基层食品检验检测机构鉴定铜绿假单胞菌的首选方法，但对检验人员的技术要求较高，存在一定的主观性；VITEK 2 Compact操作简便、耗时短，但仪器和耗材昂贵；更重要的是2种方法对铜绿假单胞菌的鉴定可能受到恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌的干扰，有造成错判的可能性。API 20E和16S rRNA基因序列分析法操作简单、准确率高，但是API 20E耗时长，16S rRNA基因序列分析法试剂昂贵，对检验人员的分子生物学水平有一定的要求。综上所述，铜绿假单胞菌的鉴定在采用GB 8538.57—2016方法的基础上还需根据实验室自身实际情况，结合VITEK 2 Compact、API 20E、16S rRNA基因序列分析法，互为佐证，提高准确率，减少误判。